Institut for Medicinsk Biokemi & Genetik
Historie:
Institut for Medicinsk Biokemi & Genetik (IMBG) blev oprettet 01.01.1993. Instituttet blev dannet ved sammenlægning af de tre tidligere biokemiske institutter (Biokemisk Institut A, B og C) og Arve-biologisk Institut. Institut for Medicinsk Biokemi
& Genetik er opdelt i fire afdelinger: Biokemisk afdeling A, B og C og Afdelingen for Medicinsk Genetik svarende til de fire oprindelige institutter.
Instituttet underviser i kemi, cellebiologi, bio-kemi og genetik for læge- og tandlægestuderende samt deltager i undervisningen for humanbiolo-ger. Herudover gives der undervisning i forskelli-ge emner på postgraduat niveau.
Biokemisk afdeling A:
Forskningsvirksomhed:
Afdelingens forskningsvirksomhed falder inden-for områderne: Stimulus-sekretions-koblingen i isolerede Langerhansske øer (1), lever- og mu-skelstofskifte (2), calciumphosphater, calciumflu-orider, knogle- og tand-materiale (3), blodtryksre-gulation (4) og metabolisk reblodtryksre-gulation, specielt i lever og muskler (5).
1. Undersøgelser over stimulus-sekretions-koblin-gen i isolerede Langerhansske øer
1.1 Undersøgelser over diacylglycerol (DAG) om-sætning i glucose-induceret insulinsekretion I modsætning til carbacholin stimulation fører glucose stimulation af phosphoinositid specifik phospholipase C ikke til DAG akkumulation i Lan-gerhansske øer. Baggrunden for disse forskelligar-tede effekter kan være, at glucose også stimulerer DAG omsætning, idet DAG omsættes af enzymer-ne DAG kinase og DAG lipase med danenzymer-nelse af henholdsvis phosphatidsyre og arachidonsyre (AA). Vi har nu påvist, at hæmning af DAG kinase med stoffet R59022 fører til potensering, medens hæmning af DAG lipase med stoffet RHC80267 fører til hæmning af glucose-induceret insulinse-kretion. Den hæmmende effekt af RHC80267 ef-tergøres af stoffet ACA, som i lighed med RHC80267 vides at blokere AA akkumulation i Langerhansske øer. Endvidere er det sandsynlig-gjort, at RHC80267 kan nedsætte den cytosolære Ca2+koncentration, idet RHC80267’s effekt på
in-sulinsekretionen kan efterlignes ved hæmning og ophæves ved stimulation af Ca2+influx i øerne.
Disse foreløbige forsøg tyder på, at DAG deriveret AA kan være af betydning for glucosestimuleret Ca2+influx/mobilisering i Langerhansske øer (P.
Thams, K. Capito, S.E. Hansen).
1.2 Metabolisme af phosphatidylcholin (PC) i Langerhansske øer
Syntesen og nedbrydningen af PC i Langerhans-ske øer øges i tilstedeværelse af glucose og har så-ledes muligvis betydning for regulationen af insu-linsekretionen. I Langerhansske øer hvor PC er blevet radioaktivt mærket med 3H-cholin er det fundet, at den glucose-stimulerede nedbrydning af PC væsentligst skyldes en enzymatisk aktivitet, der katalyserer en dannelse af glycerophosphoryl-cholin og fedtsyrer. Stimulationen synes at være specifik for glucose, idet en række andre insulin sekretagoger ingen indvirkning har. Den enzyma-tiske aktivitet kan ligeledes påvises i en cytosolær fraktion af Langerhansske øer, der er inkuberet med 3H-mærket PC. Enzymet stimuleres her kraf-tigt af mellitin og hæmmes af phospholipiderne, PS og lyso-PC, hvorimod PI og PE ingen effekt har.
Endvidere hæmmes enzymet af diacylglycerol og af fedtsyrerne arachidonsyre, oliesyre og palmitin-syre, ligesom der ses en hæmmende virkning af visse stoffer, der interfererer med lipidstofskiftet (RHC80267, thimerosal og indomethacin). Enzy-met synes at være uafhængigt af koncentrationen af Ca2+og Mg2+. Det må antages, at enzymet kan have en funktion som glucose sensor i de Langer-hansske øer, og at et af de dannede produkter, f.eks. arachidonsyre eller glycerophosphorylcho-lin, fungerer som second messenger for glucose (K. Capito, C.J. Hedeskov, P. Thams).
2. Udvikling og anvendelse af langtidskulturer af rotteleverceller og muskelceller
2.1 Proteinomsætningen i levercellekulturer Undersøgelser af betydningen af koncentrationer og sammensætning af aminosyrer på proteinsynte-se og degradation er fortsat. Den tidligere be-skrevne perifusionsteknik er optimeret, således at variationskoefficienten på analyserne er mindre end 5%. Det er vist, at proteindegradationen er langt mere følsom for ændringer i aminosyrekon-centrationer, der ses ved en fastetilstand sammen-lignet med følsomheden under omstændigheder, der svarer til en fodret tilstand. Der synes ikke at være nogen markant effekt af ændringer i kon-centrationen af glucose, insulin eller glucocortico-id indenfor det fysiologiske område (J. Dich, N.
Grunnet).
Biokemi og Genetik
153
2.2 Vækstfaktorers virkning på genexpression af specifikke leverfunktioner
Leveren er et af de organer, der kan regenerere fuldstændigt efter omfattende beskadigelse. He-patocytters replikation reguleres af bl.a. hormo-ner og vækstfaktorer. Primærkulturer af hepato-cytter med lav celletæthed kan anvendes som mo-del for leverceller med høj replikationsaktivitet og kulturer med høj celletæthed som model for cel-ler med lav replikationsaktivitet.
Projektets formål er at kvantificere virkningen af vækstfaktorerne HGF (hepatocyte growth fac-tor), EGF (epidermal growth factor) og IGF-1 (in-sulin like growth factor-1) på såvel leverspecifikke funktioner som genexpressionen af de proteiner, der er nødvendige for disse funktioner i hepato-cytkulturer med lav og høj replikationsaktivitet.
Det er i det forløbne år udført forsøg der viser, at vækstfaktorerne øger DNA syntesen og syntesen af cellulære proteiner i kulturer med høj replika-tionsaktivitet. I kulturer med lav replikationsaktivi-tet bevirker vækstfaktorerne en øget syntese af se-cernerede proteiner (herunder albumin), af cel-lulære proteiner og af urinstof. Der er endvidere udviklet metoder til bestemmelse af mængden af m-RNA for albumin, akut-fase proteiner, urinstof-cyklus enzymer, phosphoenolpyruvat carboxykina-se og cytochrom P450 (J. Dich, N. Grunnet i sam-arbejde med N. Tygstrup og X. Peng, Medicinsk Afdeling A, Rigshospitalet).
2.3 Karakterisering af muskelcellelinien L6 Muskelcellelinien L6 er i det forløbne år etableret og karakteriseret som in vitromodel for skeletmus-kulatur med henblik på undersøgelser af protein-og energistofskiftet. L6 er en myoblastcellelinie, der ved dyrkning på plastikskåle differentierer til myotubes, når der opnås konfluens. Det er vist, at kulturmedier tilsat IGF-1 og vitamin A syre giver den hurtigste og mest fuldstændige differentie-ring bedømt morfologisk og ved creatin kinase ak-tivitet. Det er endvidere lykkedes at opnå insulin-induceret glycogenophobning i cellerne, og det er vist, at denne er korreleret til mængden af den aktive form af glycogen synthase. Der er endvidere etableret en metode til bestemmelse af hastighe-den af proteinsyntese og -degradation.
Differentierede myotubes udviser spontane kontraktioner og der er etableret et eksperimen-telt system til elektrisk stimulation og styring af kontraktioner i cellerne (J. Dich, P. Elsner, N.
Grunnet, D. Jacobsen, B. Quistorff).
2.4 Et ultrafølsomt (»single photon count«) og præcist mikroskopisystem er blevet bygget op og nu praktisk fungerende. Vha. bioluminiscens fra ildflue-luciferase er ATP blevet fotograferet i
le-vende transfekterede muskelceller i kultur og der forventes spændende resultater af teknikken og de præliminære resultater. Endvidere er under-søgelser af frit intracellulært Ca++i disse celler be-gyndt med henblik på klarlæggelse af den meta-bolismeregulerende funktion af Ca++.
Undersøgelserne af nervecelle-signalstof-frisæt-ning er ligeledes begyndt, ligesom receptorfunkti-oner og lokalisatireceptorfunkti-oner af betydning for disse fri-sætninger er undersøgt vha. immunoguldmærk-ning m. sølvforstærkimmunoguldmærk-ning. Således er en lang ræk-ke GABA-receptor-subunit/mRNA lokalisationer næsten færdigundersøgt. Projekterne foregår i samarbejde med N. Grunnet, J. Dich, B. Quistorff, A. Schousboe, Danmarks Farmaceutiske Højskole og G.H. Hansen (Bo Belhage).
3. Krystal-kinetiske undersøgelser af bio-minera-ler
Arbejdet sigter mod forebyggelse og behandling af såvel tand- og knoglesygdomme som af frem-komst af nyre- og galdesten. Specielt undersøges dannelses-, vækst- og opløsningsprocesser af tungt-opløselige calciumforbindelser og tilsvarende ke-ramisk knogleimplantat-materiale. Undersøgelser-ne sigter også mod en udbygning af den moleky-lære beskrivelse af processer i krystaloverflader, herunder også makromolekylers interaktion med disse processer. Der studeres dannelses-, vækst- og opløsningskinetik af fluorapatit, FAP, dannelse af phosphatholdige calciumfluorid-krystaller, hvis fremkomst i suspensioner af hydroxylapatit, HAP, eller FAP medfører destruktion af HAP og FAP.
Formålet er dels uddybning af forståelsen af, at fluoridionen i lav koncentration hæmmer caries og eventuelt fremmer knoglemineralisering, dels at bekræfte/afkræfte teorien bagved behandling af initiale carieslæsioner med sur fluoridop-løsning. Der fremstilles strontium-holdige HAP, hvis x-ray-absorption undersøges for at bekræfte eller tilbagevise teorien om, at visse organiske, strontiumholdige medikamenter in vivo øger mas-sen af knoglemineral. Til belysning af hydrogen-ionens reaktion med calciumphosphat-krystaller følges omdannelse af krystallerne til tilsvarende deutererede krystaller og omvendt (J. Christoffer-sen, M.R. ChristofferChristoffer-sen, T. Johansen).
4. Undersøgelser over renin-angiotensin systemet Den metode vi har udarbejdet til direkte måling af koncentrationen af humant angiotensinogen (HA) i plasma, et ELISA-system, anvendes sam-men med en direkte målemetode, radioimmuno-assay, RIA, til at måle HA, før og efter HA er blevet spaltet af renin til angiotensin I og des-angioten-sin I angiotendes-angioten-sinogen (des-AI HA). Da antistoffet genkender HA vha. en antigen determinant
downstream i forhold til angiotensin I i ELISA-sy-stemet, og RIA’en måler angiotensin I, der sidder N-terminalt på HA-molekylet, kan vi måle den om-satte mængde HA, idet RIA måler den biologisk aktive del af HA og ELISA måler HA + des-AI HA.
Forholdet mellem HA/des-AI HA vil belyse renin-angiotensin systemets biokemi.
Vi arbejder med at optimere en metode til esti-mering af disse to metabolitter vha. ionbytter-HPLC, hvor metabolitterne vil blive adskilt og målt samtidigt.
Identifikation af angiotensin I og II og deres metabolitter samt højmolekylære angiotensiner i rotteplasma foretages vha. HPLC, SDS-PAGE og Western blot.
Vi arbejder desuden med optimering af en dyre-eksperimentel model for malign hypertension, i samarbejde med Medicinsk Fysiologisk Institut.
Undersøgelser pågår over NO synthase, funktion og koncentrationen i aorta-endothel, cerebellum og tarm, efter behandling med stimulatorer og/el-ler hæmmere af NO synthase, set i forbindelse med malign hypertension og stimulation af hjernevæv.
Undersøgelserne foregår i samarbejde med over-læge, dr.med. M. Lauritzen, KAS Glostrup, læge E.
Lauritzen, Rh. og direktør, professor, dr.med. J.
Giese, Rh (Tracey Warby, Inger Rubin).
5. Panum Instituttets NMR Center Projekt
Panum Instituttets NMR Center blev etableret ved en undervisningsministeriel bevilling i 1989/90.
Centerets forskning ligger indenfor emnet meta-bolisk regulation, herunder specielt regulation af glycogenolyse, glycolyse og oxidativ fosforylering i lever og muskler. Der er etableret et udstrakt tvær-disciplinært samarbejde med det formål at kunne belyse en given problematik både i eksperimentel-le modeleksperimentel-ler (celeksperimentel-lekulturer, perfunderede organer, intakte forsøgsdyr) og mennesker, enten under fysiologiske omstændigheder eller i klinisk sam-menhæng. Fra 1.2.1994 har centeret været en del af Grundforskningsfondens Muskelforskningscen-ter. I det forløbne år er der arbejdet med følgende projekter:
5.1 Undersøgelse af regulation af glycolyse i ske-letmuskulatur, dels hos normale forsøgspersoner, dels i en model med perfunderede muskler fra rotter
Forsøgene på mennesker viste overraskende, at den traditionelle opfattelse af glycolyseregulation via metaboliske aktivatorer, såsom uorganisk fos-fat, AMP og ADP næppe er korrekt, men at glyco-lysen øjensynlig er intimt sammenkædet med sel-ve kontraktionsprocessen. Undersøgelserne
vide-reføres m.h.p. at belyse calciums og det cytosolære redoxforholds rolle i glycolyseregulationen, dels i den ovenfor omtalte perfunderede model, dels i en muskelcellelinie i kultur (L6 celler). Desuden gennemføres målinger af glycolysehastigheden på skeletmuskulatur hos patienter med malign hy-perthermi samt i en eksperimentel model med slagtesvin, som er heterozygote med hensyn til et specifikt gen, som menes at ligge til grund for den phenotypiske udvikling af malign hyperthermi.
5.2 Undersøgelser af regulationen af Oxidativ fosforylering og adeninnucleotidstofskiftet i lever Vi viste for et par år siden, at uorganisk fosfat er en væsentlig regulator for leverens iltforbrug un-der forskellige graun-der af fysiologisk belastning i form af urinstof-, glucose- og glycogensyntese. Dis-se eksperimenter er videreført i årets løb, hvor der blandt andet er anvendt en transgen mus, karakte-riseret ved at enzymet creatinkinase er udtrykt i le-veren, hvor det normalt ikke forekommer. Man kan således sige, at leveren fra en energimetabo-lisk betragtning på denne måde er bragt til at fun-gere som en muskel. Med denne model under-søges creatintransporten i lever, og tillige i hvor høj grad creatinfosfat under tilstedeværelse af cre-atinkinase fungerer som »energibuffer« under en given belastning med hensyn til at opretholde cel-lens ATP niveau.
5.3 Undersøgelse af fosfatstofskiftet i tumorceller Der arbejdes specielt med 2 tumorcellelinier CPH 54A og CPH 54B samt med Ehrlich tumorceller.
Undersøgelserne har været centreret om, ved hjælp af NMR spektroskopiske teknikker, at påvise energimetaboliske ændringer i disse tumorcelle modeller ved forskellige former for antitumorte-rapi (ioniserende stråling og cytostatica). Under-søgelserne er gennemført både på cellekulturer og på solide tumorer, hvor de to cellelinier er im-planterede i flanken på nøgne mus. Resultaterne sandsynliggør, at Pi/ATP ratio i tumor vil kunne anvendes som behandlingsparameter ved tilsva-rende terapi på mennesker. I Ehrlich tumorceller har arbejdet især drejet sig om at belyse hvorledes ændringer i den extracellulære creatin-koncentra-tion påvirker cellernes energimetabolisme og vækst. Herudover er der gennemført et betydeligt metodologisk arbejde, dels m.h.p. at kunne opfor-mere Ehrlich tumorcellerne ved fermentor-teknik og på denne måde opnå en homogen cellepopu-lation i tilstrækkelig mængde, dels i form af udvik-ling af NMR teknik til kontinuerlig måudvik-ling af Ehrlich tumorceller. Denne model vil umiddel-bart kunne nyttiggøres i forbindelse med NMR spektroskopiske undersøgelser af andre isolerede celler.
Biokemi og Genetik
155
Nye faciliteter:
Der er i årets løb arbejdet systematisk på at udvik-le D NMR spektroskopisk optageteknik. Med 3-D Fourier teknik er det nu muligt på et isoleret præparat at nå en rumlig opløsning svarende til en pixelstørrelse på 10-7ml. I forbindelse hermed er der etableret yderligere 3-D billedbehandlings-faciliteter baseret på en Silicon Graphics arbejds-station og bl.a. programmet VoxelView.
Gæsteforskere:
Dr. Jean Pierre Mattei, Faculté de Médecine, Mar-seille, Frankrig, 1 måned. Dr. Vasilis Ntziachristos, University of Thessaloniki, Grækenland, ialt 3 måneder. Dr. Edward Povilonis, Dept. of Compu-ter Science, Vilnius University, Vilnius, Litauen, 1 måned. Dr. Aivaras Ratkevicius, Lithuanian Insti-tute of Physical Education, Kaunas, Litauen, ialt 8 måneder.
(Hanne Friis Bøtte, Peter Elsner, Claus Kristen-sen, Masao Mizuno, Birthe Moesgaard, Peter Fæster Nielsen, Markus Nowak, Morten Høgholm Pedersen, Bjørn Quistorff, Jesus Rico Sanz, Ken-neth Smith).
Biokemisk Afdeling B:
Forskningsvirksomhed:
Afdelingens forskning har i en årrække haft ho-vedvægt på studier af nucleinsyrers egenskaber og syntese samt på forskellige regulationsmekanis-mer for den levende celle.
Fedtsyretransport
Transporten over den humane erythrocytmem-bran af palmitin-, olie- og arachidonsyre er stude-ret ved selvudvekslingsforsøg. Vi har vist, at der findes et begrænset antal specifikke bindingsste-der hvis membranfordeling og affinitet er forskel-lig for de tre syrer. Desuden er hastighedskonstan-terne for transporten forskellige. Resultahastighedskonstan-terne ty-der på fedtsyre-specifikke transportsystemer. Der-for er den indbyrdes konkurrence om såvel mem-branbinding som transport undersøgt. Forsøgene viser, at syrerne ikke konkurrerer hverken om bin-dings- eller transportfunktion. Forsøg er igang med at identificere de involverede proteiner (I.N.
Bojesen, E. Bojesen).
Cellekerne struktur
Det er en udbredt opfattelse, at chromatinfibrene i cellekernen er forankrede til et kerneskelet, be-stående af et netværk af proteiner. Da et sådant netværk kun kan påvises efter ekstraktion i meget høje saltkoncentrationer (i form af en såkaldt nu-clear matrix), hersker der dog tvivl om dets eksi-stens i den levende celle. I et forsøg på at afklare
dette spørgsmål har vi udviklet en teknik, der gør det muligt at analysere cellekerner ved cationkon-centrationer, der imiterer de intracellulære for-hold. Vore resultater kan ikke bekræfte eksisten-sen af et kerneskelet, men teknikken muliggør en analyse af aktive geners lokalisering og struktur, bl.a. ved hjælp af elektronmikroskopi (Mogens Engelhardt).
Regulering af genekspression
De ribosomale 5S rRNA gener er velegnede til at undersøge genekspression, idet der foruden ægte gener, også findes genvarianter og pseudogener.
Gener er isoleret fra humane og animalske celler og de DNA sekvenser, der har betydning for gen-regulering i de respektive celler, karakteriseres.
En enkelt sekvens, der er bevaret i gener fra for-skellige arter, er af stor betydning for regulering, selvom også artsspecifikke forskelle ses. Ved in situ hybridisering til kromosomer fra humane celler og fra andre animalske celler bestemmes gener-nes lokalisation. Undersøgelsen udføres i samar-bejde med Bodil Lomholt, Afdelingen for Medi-cinsk Genetik (Sune Frederiksen, Charlotte Hal-lenberg, Jesper Andersen, Lars Riff Jensen).
Celleoverlevelse
Efter i en årrække at have arbejdet med vækstfak-torer og de fysiske fakvækstfak-torer, der har indflydelse på vækst, er vi nu optaget af at forstå betingelserne for celleoverlevelse og celledød. Vi anvender kul-turer af Tetrahymena i kemisk defineret medium og har fundet, at celleoverlevelse afhænger af en række fysiske forhold og af tilsatte effektorer (hor-moner og signalstoffer). Meget tyder på at celler-nes egen-konditionering er af stor betydning for celleoverlevelse. De biokemiske og molekylær-bio-logiske forhold herved vil blive undersøgt (Per Hellung-Larsen, Joachim J. Hagemeister, Thomas B. Kristiansen, Michael Grave).
Virkningen af akkumulering af ATP eller GTP på cellevolumenet i pattedyrceller
De betingelser (høj koncentration af orthophos-phat og pH 6.5 eller pH 7.0 i dyrkningsmediet), som vi tidligere har fundet at være optimale for omdannelse af adenosin og af adenosinanaloger til de tilsvarende triphosphater i Ehrlich tumor celler, har nu vist sig også at tillade et øget cellu-lært indhold af GTP uden at ATP-indholdet påvir-kes. GTP-indholdet kan således stige til det ca. 8-dobbelte ved tilsætning af stigende koncentratio-ner af guanosin. Stigende GTP indhold forårsager et cellulært tab af K+og Cl-og af vand, resulteren-de i nedsættelse af cellevolumenet med 20-25%.
Øgning af cellulært indhold af ATP med adenosin som substrat forårsager også tab af KCl og
volu-menreduktion. Ved den samme øgning af de mo-lære indhold af de to triphosphater fås omtrent den samme effekt på cellevolumenet. Mekanis-men bag dette fænoMekanis-men synes at være forskellig fra den, som gælder for volumenreduktion efter svulmning når celler overføres til hypotont medi-um, idet en række stoffer, som hæmmer sidst-nævnte fænomen, ikke påvirker volumenredukti-on fremkaldt af øget indhold af GTP (Hans Klenow, Mads Marcussen, Kay Overgaard-Han-sen).
Karakterisering af et kemosensorisk system Tidligere undersøgelser af ciliaten Tetrahymena thermophilas kemosensoriske svømmeadfærd har vist, at organismen bevæger sig i gradienter af kemoattraktanter ved hjælp af mekanismer, der både involverer tidsafhængige mekanismer og en rumlig orienteringsevne hos cellerne. Under-søgelser af membranreceptorer for plantelectinet concanavalin A, der er af betydning for cellernes evne til rumlig orientering og vedholdenhed i svømmeadfærden, er blevet videreført i samarbej-de med prof. Stephen Kaufman, University of Il-linois, USA samt docent Thorkild Bøg-Hansen, Proteinlaboratoriet. Lectinet concanavalin A in-terferer kun med cellernes vedholdenhed i svøm-meadfærden, men ikke med cellernes evne til at adaptere til en kemoattraktant. Fluorescensmær-ket concanavalin A binder selektivt til membran-elementer (receptorer) placeret i forenden af cel-lerne og kan være del af en membranstruktur, der er involveret i cellernes evne til at orientere sig rumligt (Vagn Leick).
Struktur og funktion af RNA-molekyler
Laboratoriet beskæftiger sig med opklaring af strukturen af specifikke RNA molekyler og deres tilknyttede proteiner, herunder udvikling af nye metoder. Med baggrund i de strukturelle studier undersøges funktionen af specifikke RNA moleky-ler i to biologiske systemer. I det ene system un-dersøges nogle små RNA komponenter, som fin-des i eukaryote cellekerner. Hovedinteressen er samlet om nogle af os opdagede nukleolære kom-ponenter, som bl.a. undersøges for katalytisk akti-vitet i forbindelse med forarbejdning af forstadier af ribosom RNA. Det andet biologiske system er fosterudvikling hos rotten, hvor vi studerer udtryk af nogle gener, som koder for plasmaproteiner.
Vores arbejde har sandsynliggjort, at disse protei-ner har flere funktioprotei-ner under fosterudviklingen.
Arbejdet omfatter såvel ekspressionsstudier, her-under in situ hybridisering som biokemisk karak-terisering af mRNA strukturen (Henrik Nielsen, Susanne Søgaard Nielsen, Troels Bygum Knud-sen).
DNA-genkendelse
Syntetiske reagenser, der binder sekvensspecifikt til DNA, har et potentiale som genmålrettede lægemidler. Vi har i samarbejde med Kemisk La-boratorium II, H.C. Ørsted Institutet, udviklet et
»DNA-molekyle« med peptid »backbone«, kaldet PNA (peptide nucleic acid). Binding af PNA til en-keltstrenget DNA og RNA sker ved Watson-Crick baseparring og binding til dobbeltstrenget DNA sker ved strengfortrængning. Vi har vist, at PNA kan fungere som genspecifik transskriptions regu-lator in vitro (syntetisk transskriptionsfaktor).
PNA’s potentiale som genspecifikt antisense og antigen lægemiddel undersøges (Peter E. Nielsen, Niels Erik Møllegaard, Magdalena Eriksson, Søren Holst Sönnichsen, Jakob Larsen, Helle Knudsen, Jens Nederby Nielsen, Kristine K. Jensen, Thomas Bentin).
Redaktionsvirksomhed:
Peter Nielsen: Referee for Nucleic Acids Res., Bio-chemistry, Eur. J. BioBio-chemistry, Bioconjugate Che-mistry, J. Molecular Recognition, J. Med. Chemis-try, J. Amer. Chem. Soc., Acta Chem. Scand., Ori-gin of Life. Advisory editor on »Bioconjugate Che-mistry« (ACS), »Journal of Molecular Recogniti-on«, »European Bulletin of Drug Research«, og
»Chemistry, A European Journal«.
Biokemisk afdeling C:
Forskningsvirksomhed:
Afdelingens forskningsaktiviteter omfatter op-rensning og karakterisering af proteiner og hor-moner, studier af normale og patologiske proces-ser knyttet til biologiske membraner samt under-søgelser af de molekylære forandringer, der op-står ved stimulering og hæmning af cellevækst.
Sigtet med en del af instituttets forskning er at be-lyse basale cellebiologiske fænomener, som ved-rører biosyntese og intracellulær transport af membranproteiner, signaltransduktion og aktive-ring og reguleaktive-ring af blodkoagulation og fibrino-lyse. En sådan forøget viden er af betydning for forståelsen af normale og patologiske cellers feno-type og af proteiners og hormoners funktion.
Insulinreceptoren
Studier over insulinreceptorens struktur og funk-tion er fortsat. Det er lykkedes at indsætte recepto-ren i intakte celler. Antallet af receptorer kan i he-patocytter øges ca. 2 gange. De indsatte recepto-rer er funktionelt intakte og kan kobles til det in-tracellulære effektorsystem som vist ved phospho-rylering af insulinreceptor substrat 1 og øget insu-linstimuleret glycogensyntese. Metoden til indsæt-ning af insulinreceptoren i intakte celler kan
an-Biokemi og Genetik
157
vendes til at studere signaloverførslen og effekten af variation i receptorantal ved insulins virkning på specifikke cellers metabolisme.
Undersøgelser over signaltransduktionsvejen for glycogensyntese i levercelle er påbegyndt lige-som fremstilling af antistoffer mod phosphatidy-linositoler, der er phosphoryleret i 3-stillingen, er under udvikling. Studiet udføres i samarbejde med J. Vinten, Med. Fys. og J. Tranum-Jensen, Med.-anat. (Kirsten Christiansen, Jens Carlsen).
Oxidativ phosphorylering
Patienter, som efter traumer udvikler svigt af flere organer, udviser, som det også er tilfældet under ekstrakorporal cirkulation, nedsat oxygenekstrak-tion. I samarbejde med 1. reservelæge Ulrich An-dersen og overlæge Lars Villy AnAn-dersen, RH, fore-tager vi indledende forsøg med rotte mitochon-drier for senere at undersøge, om der under disse forhold forekommer en serumfaktor, som påvir-ker mitochondriernes respiration (Jens Carlsen, Kirsten Christiansen).
Membrantransport af lipophile molekyler Resistensmekanismer overfor lipophile (fedtop-løselige) cytostatika i multidrug-resistente tumor-celler studeres ved en kombination af moleky-lærbiologiske og fysisk-kemiske metoder. Stoffer-nes membrantransport karakteriseres ved compu-ter modelberegninger og fotoaffinitets-mærkning af transportproteiner. I et sideløbende projekt ar-bejdes der med udvikling af en ny teknik til foto-metrisk måling af lipophile anioner. Metoden, der anvender kemisk modificeret serum albumin som
»detektor«, åbner nye muligheder for kinetisk ana-lyse af bl.a. fedtsyretransport i cellemembraner.
Samarbejde med P.B. Jensen, E. Friche, B. Holm (Rigshospitalet) og M. Sehested (Sundby Hospi-tal) (E. Demant, K. Christiansen, J. Carlsen).
Transkriptionel regulering
Karakteriseringen af aminopeptidase N genets transkriptionelle regulation i Caco-2 celler under differentiering er fortsat. En enhancer er lokalise-ret til området mellem position -1,7 kbp og -2,5 kbp. Foreløbige analyser indikerer, at enhanceren bevirker en differentierings-afhængig stimulation af aminopeptidase N transkriptionen samt at sti-mulationen modvirker en samtidig differentie-rings-afhængig transkriptionel nedregulering, me-dieret via det proksimale Sp1 element. Igang-værende analyser sigter dels på at identificere de aktive elementer i enhanceren og dels på at klar-lægge den Sp1-medierede nedregulering.
Undersøgelserne af den progesteron/chorion gonadotropin inducerede aminopeptidase N eks-pression i endometrium i samarbejde med I.
Clas-sen-Linke, Universitetet i Aachen, er afsluttet. Det er ved hjælp af specifikke antisera vist, at den op-regulerede HNF1 aktivitet i endometrium ud-gøres af vHNF1 homodimerer. Det er endvidere sandsynliggjort at den UF bindende aktivitet i en-dometrium udgøres af faktoren COUP-TF, som er en transkriptionsfaktor tilhørende steroidhormon receptor familien.
Et studium af den myeloide aminopeptidase N promoter er igangsat i samarbejde med A. Kehlen, Martin-Luther Universität, Halle, som har været gæsteforsker på instituttet samt L. Shapiro og A.T.
Look, St. Jude Children’s Research Hospital, Ten-nessee. Deletionsanalyser af den TATA box-frie promoter udført i to T-celle linier (HUT 78 og Jur-kat) samt i erythroleukæmi cellelinien K562 har vist tilstedeværelse af flere positive og et enkelt ne-gativt virkende cis-element. Betydningen af disse cis-elementer samt en HUT 78 specifik faktor ana-lyseres for nærværende.
Sekventeringsarbejdet af dipeptidyl peptidase IV promoteren er blevet fortsat, sådan at sekven-sen nu omfatter ialt 1200 bp. Indenfor de første 300 bp af promoteren findes bl.a. flere Sp1 og Ap-2 elementer samt et Ap-1 og et ETF element.
Promoteren er meget GC-rig (omkring 70% in-denfor de første 300 bp). For yderligere at kort-lægge regulatoriske elementer er transfektionsfor-søg med en serie deletioner koblet til globin som reportergen blevet påbegyndt.
Den funktionelle karakterisering af et 1 kb promoterfragment af lactase-phlorizin hydrolase genet er blevet fortsat. Forskellige deletioner af promoterfragmentet koblet til et reporter gen er blevet transfekteret i koloncancer cellelinien Caco-2. Cis-elementer med betydning for tran-skriptionen er herved blevet lokaliseret og efter-følgende karakteriseret. Således ses en effekt på transkriptionen ved deletion af det tidligere be-skrevne cis-element (CE-LPH1). Deletion af en enhancer region 900 bp opstrøms for transkripti-ons-initieringsstedet giver ligeledes et kraftigt fald i promoteraktiviteten, hvorimod tilsvarende for-søg mellem 200 og 300 bp opstrøms for transkrip-tions-initieringsstedet har påvist et negativt regule-rende element. I denne region findes en consen-sus bindingssekvens for den nyligt klonede tran-skriptionsfaktor FREAC-3. Vi har i samarbejde med Peter Carlsson, Göteborgs Universitet, vist, at rekombinant FREAC-3 binder til dette element, og skal nu fortsætte samarbejdet med at under-søge om denne binding af FREAC-3 har funktio-nel betydning.
Projektet, der sigter mod at oprense og klone den tarm-specifikke kerne faktor NF-LPH1 som binder til CE-LPH1, er fortsat. Vi har delvist op-renset NF-LPH1 fra Caco-2 ekstrakter og fra