Formaalet med disse Undersøgelser var at fremskaffe et normalt Materiale, der kunde benyttes som et Sammenligningsgrundlag ved Vur-dering af Clearance hos tilfældige Hunde, samt bestemme, hvor stor Spredningen vilde blive ved gentagne Undersøgelser af Nyrefunktionen hos den enkelte Hund. Undersøgelserne blev dels foretaget paa Hunde indkøbt til Laboratoriet og dels paa Hunde, der var indlagt paa den kgl. Veterinær- og Landbohøjskoles Klinik for mindre Husdyr. Paa disse sidste blev der kun foretaget et enkelt Forsøg med to Clearance-perioder. Der blev kun benyttet Hunde, hvor der efter klinisk Under-søgelse ikke kunde paavises noget Tegn paa Lidelser, der kunde influ-ere paa Nyrefunktionen. Paa Laboratoriets Hunde blev der, efter at Dyrene var dræbt, yderligere foretaget Obduktion. Der blev foretaget 36 Forsøg med 16 Hunde; Resultaterne af disse Undersøgelser er sam-let i Tabel 3.
Da det som Følge af Krigen kun var muligt at skaffe nogle enkelte Ampuller Perabrodil ( = Diodrast), blev det besluttet at anvende Hip-podin (— Hippuran), der kunde fremskaffes i tilstrækkelige Mængder.
Da Elsom, Bott og Shiels (31) Undersøgelser tyder paa, at dette Stof har lavere Clearance end Diodrast, muligvis som Følge af en stærkere Proteinbinding, Smith og Medarbejder (146), udførte jeg nogle Forsøg med Perabrodilclearance til Sammenligning med Hippodinclearance.
Resultatet af Perabrodilforsøgene er vist i Tabel 4. Medens Hippodin-clearance for Hund 1 og 2, Tabel 3, var 185 og 179 cc, gav Perabrodil-clearance Værdierne 198 og 190. PerabrodilPerabrodil-clearancerne synes saaledes at ligge 6—8 pCt. højere end Hippodinclearance. Ved Anvendelse af Perabrodil fandtes Forholdet Inulinclearance/Jodclearance til ca. 0,30, medens det ved Anvendelse af Hippodin var ca, 0,33.
Det samlede Materiale blev anvendt til Bestemmelse af den normale Clearanceværdi pr. 100 g beregnet Nyrevæv. For Hippodinclearance fandtes denne at være 191 + 21 cc og for Inulinclearance 64 + 12 cc.
Det giver Forholdet Inulinclearance/Hippodinclearance 0,335. Det frem-gaar af Tabellen, at den Sikkerhed, hvormed Clearance har kunnet be-stemmes, varierer betydeligt fra Hund til Hund, uden at det er muligt at give nogen Grund herfor. Taget som Helhed viser disse
Undersøgel-42
ser, at den enkelte Iagttagelse, baade for Inulin og Hippodin, er behæf-tet med en Middelfejl paa gennemsnitlig 7—8 pCt.
Den Nøjagtighed, hvormed Inulinclearance har kunnet bestemmes, er praktisk taget den samme som den, hvormed Summerville, Hanzal og Goldblatt (156) ' kunde bestemme Urinstofclearance (over »aug-mentation limit«) paa Hunde. Paa 23 Hunde fandt de Urinstofclearance til 53 + 11,4 pr. m2 Overflade. Dyrenes Overflade bestemte de efter Cowgill og Drabkins Formel (20). Corcoran og Page (18) finder Blod-gennemstrømningen hos normale Hunde til 460 cc (Plasmagennem-strømningen 250 cc) pr. m2 Overflade pr. Minut + 61, bestemt ved Phenolrødtclearance, korrigeret for den mangelfulde Extraktion. Inu-linclearance finder de til 69 + 14,8 pr. m2 Overflade, Phenolrødt-clearance: 118 + 25 pr. m2 Overflade.
KAPITEL V.
Analysemetoder.
Inulinbestemmelse.
I de første Arbejder, der blev udført med Inulin til Nyrefunktions-prøver, bestemtes Inulinet efter den af Somogyi og Skaffer udarbej-dede Metode (151), hvorefter Inulinindholdet blev bestemt ved Kul-hydraternes samlede reducerende Evne, dels før og dels efter Syre-hydrolyse, idet man ved denne Proces faar Inulinet hydrolyseret til Fruktose. Denne Metode er meget besværlig og kun tilstrækkelig nøj-agtig, naar Inulinkoncentrationen i den Vædske, der skal undersøges, er mindst 50 mg pCt. For at opnaa denne Plasmakoncentration var det nødvendigt at anvende kontinuerlig intravenøs Infusion af Inulin-opløsning under hele Glearanceperioden.
I senere Arbejder er anvendt kolorimetriske Metoder til Bestem-melse af Inulinkoncentrationen, disse bygger alle paa det Forhold, at Inulinet ved Kogning med Syre hydrolyseres til Fruktose, der med Diphenylamin giver blaa Farve. Denne Metode er først anvendt af Ihl og Pechmann og senere af Jolles (69) til kvantitative Inulinbestem-melser. Af van Creveld (21) er Metoden anvendt kvantitativt til Be-stemmelse af Inulinkoncentrationen i Plasma. Metoden er senere mo-dificeret af Oppel (100). Denne lod Reaktionen mellem Fruktose og Diphenylamin foregaa i vandig Opløsning. Da Diphenylamin og dettes blaa Farveforbindelser med Fruktose er uopløseligt i Vand, maatte Farven ekstraheres af den vandige Opløsning med Æthylalkohol, Amyl-alkohol, Propylalkohol eller andet Stof, hvori Farveforbindelsen er op-løselig, før Kolorimetri kunde foretages. Herbert (55) viste, at Farve-forbindelsen kunde holdes i Opløsning ved Tilsætning af tilstrækkelig Mængde Æthylalkohol. Alving og Medarbejdere (4) anvender en
Blan-44
ding af Saltsyre og Æthylalkohol tilsat Diphenylamin. Kogningen fore-tager de i svære Duranglas, der er forsynede med Skruelaag. De an-vender Kogning i 60 Minutter. Røjel (123) har anvendt denne Metode, men anvender Glas med Gummiprop. Han meddeler, at maksimalt Farvedannelse er naaet efter 30 Minutters Kogning. Jensen (66) an-vender en Blanding af Propylalkohol og koncentreret Saltsyre, til denne Blanding sætter han Diphenylamin opløst i Propylalkohol. Han angi-ver, at der ved Blanding af Propylalkohol og koncentreret Saltsyre fremkommer en svag rød Farve. Anvendelse af Propylalkohol i Stedet for Æthylalkohol har den Fordel, at Glassene ikke udsættes for saa højt et Tryk, idet Propylalkohol først koger ved 97 ° C. Kogningen fore-tages i tilsmeltede Ampuller. Jensen (66) angiver, at maksimal Farve-dannelse først indtræder efter 60 Minutters Kogning, og at der ved længere Tids Kogning sker en Forøgelse af Farvedannelsen saavel i Inulinprøven som i Blindprøven. Denne Farvedannelse maa, da den indtræder saavel i Blindprøven som i Inulinprøven, antagelig skyldes Urenheder i Reagenserne.
Jeg har forsøgt at anvende Alvings og Medarbejderes Metodik, idet jeg dog ligesom Jénsen (66) har anvendt Propylalkohol, tillige har jeg søgt at anvende Glas med Gummiprop, men disse angribes af Saltsyre-Propylalkoholblandingen og foraarsager en Gulfarvning eller Grønfarv-ning af Prøverne. Jeg har derfor anvendt svære Reagensglas (13,5
X 1,8 cm) af Duranglas med Glasprop, der fastholdes af en Bøjle med Spændeskrue (Fig. 4).
For at undgaa den af Inulinkoncentrationen uafhængige Farve-dannelse i Inulinprøve og Blindprøve, som muligvis skyldes Peroxyder dannet i Propylalkoholen ved længere Tids Henstand, er denne behand-let med metallisk Natrium og Ferrosulfat og derefter destilleret. Til 1 Liter Propylalkohol sættes 5 mg metallisk Natrium; naar dette er opløst, tilsættes 10 g Ferrosulfat, der foruden at virke reducerende ogsaa forhindrer Stødkogning. Propylalkoholen destillerer over ved 97 ° C. De første 10 cc Destillat bortkastes. Naar Destillationstempera-turen stiger til 99 ° C., afbrydes Destillationen.
Med saaledes behandlet Propylalkohol har jeg ikke kunnet iagttage nogen Farvedannelse ved Sammenblanding af koncentreret Saltsyre og Propylalkohol. Da Kogetidens Længde angives -saa forskellig, har jeg undersøgt dennes Indflydelse paa Farvedannelsen, idet der er anvendt nedennævnte Metodik. Der er undersøgt vandige Inulinopløsninger og
4 5
Plasma, hvortil er sat Inulin. Tillige er der undersøgt en vandig Inulin-opløsning behandlet med Fældningsreagenserne. Resultatet fremgaar af Fig. 5.
For alle Opløsningers Vedkommende er Farvedannelsen maksimal efter 40 Minutters Kogning. Ved Undersøgelsen af den vandige Blind-prøve (Vand — Diphenylaminreagens) efter Kogning i 75 Minutter og Aflæsning overfor en ikke kogt Prøve, viste det sig, at der ikke havde fundet nogen Farvedannelse Sted. Farvedannelsens Hastighed i en Plasmablindprøve og i en Plasmaprøve tilsat Inulin er undersøgt overfor en vandig Blindprøve. Resultatet fremgaar af Fig. 6. Det ses, at Afstanden mellem Kurverne (Inulinvirkningen) er maksimal efter 40 Minutters Kogning, medens den Farvedannelse, der skyldes Plasmaets egen kromogene Evne, først er maksimal efter 75 Minutters Kogning.
46
Fig. 5. Kogetidens Indflydelse p a a Farvedannelsen. A: 20 og B: 10 mg pCt.
Inulin i vandig Opløsning. D: 20 mg pCt. Inulin i vandig Opløsning behandlet med Fældningsreagenserne. D: 5 mg pCt. og E : 15 mg pCt. Inulin i Plasma,
aflæst overfor en P l a s m a Kontrolprøve.
Analysemetoden:
Reagenser:
Diphenylamin cryst. pro analysi (Schering).
Propylalkohol, normal, redestilleret over Natrium og Ferrosulfat.
Saltsyre kone. pro analysi.
Diphenylaminreagens: *
A. 10 g Diphenylamin opløses i 100 cc Propylalkohol (opbevares i Mørke).
B. 200 cc koncentreret Saltsyre blandes med 275 cc Propylalko-hol. Før Brugen blandes 5 cc af A med 95 cc af B (Maale-kolbe).
4 7
Fig. 6. Kogetidens Indflydelse: A: 8 mg pCt. Inulin i P l a s m a , aflæst overfor vandig Blindprøve. B: Plasmablindprøve aflæst overfor vandig Blindprøve.
Fremstilling af Standardkurve. Inulin (Merck) tørres i Varmeskab ved 90—100 ° G. til konstant Vægt, afkøles i Exsiccator. Af dette Inulin fremstilles en Stamopløsning, der indeholder 100 mg pCt. Inulin. Fra Stamopløsningen fremstilles Inulinopløsninger indeholdende 5, 10, 20, 25, 30 mg pCt. Inulin. Disse Opløsninger anvendes til Fremstilling af en Standardkurve.
I eet af Analyseglassene afpipetteres V2 cc destilleret Vand, i andre Glas afpipetteres V2 cc af en af de ovenfor nævnte Inulinopløsninger.
Der tilsættes Diphenylaminreagens til Mærke (10,5 cc). Glassene lukkes med Glaspropper, og disse fastspændes med Spændeskruerne. Glassene anbringes i et Metalstativ og nedsænkes i et kogende Vandbad. Efter Af-køling paa Vandbad til Rumfang IOV2 cc foretages Aflæsning af Farve-dannelsen i Pulfrich-Fotometer, der anvendes 2 cm Guvette og Filter S. 61.
48
Middeltallene af de for hver Prøve foretagne Aflæsninger afsættes ad Ordinaten i et Koordinatsystem. Ad Abcissen i dette afsættes Inulin-koncentrationerne Det vise? sig da, at de aflæste Middelextinktioner ligger paa en ret Linie og følger den Lambert-Beerske Lov (Fig. 7).
Fig. 7. Inulin Standardkurve. Hvert P u n k t er den aritmetiske Middelværdi af 4 Bestemmelser.
Inulinbestemmelser i Plasma: I alle Arbejder, hvor den reduk-tionstitrimetriske Inulinbestemmelse har været anvendt, og i en Del af de Arbejder, hvor der er foretaget kolorimetriske Bestemmelser af Inulinet, har man fjernet Glukosen fra Plasmaet ved Forgæring, idet der er sat Gærceller opslemmet i destilleret Vand til Plasmaet. Efter Forgæring fracentrifugeres Gærcellerne. For at bestemme Fortyndings-graden af Plasmaprøven ved Gærtilsætningen er Gærcellernes Volumen-procent bestemt i Hæmatokrit. Da Hæmatokritbestemmelser er temmelig unøjagtige, Plasmaets kromogene Evne ret ringe, og da man endvidere
49
korrigerer for denne kromogene Evne ved Anvendelse af en Plasma-blindprøve i Fotometerets Komparatorkuvette, har jeg, som det ogsaa er gjort af Røjel (122), undladt Forgæring af Glukosen. Dette er dog kun tilladeligt, saafremt Blodsukkerkoncentrationen ikke ændres i For-søgsperioden. Der er derfor foretaget en Blodsukkerbestemmelse (Hage-dorn-Jensen) paa en Blodprøve taget før Forsøgets Begyndelse og en Blodprøve fra hver Clearingsperiode. Der er ikke under de anvendte Forsøgsbetingelser fundet væsentlige Svingninger i Blodsukkerkoncen-trationen.
Fældning af Plasmaproteinerne foretages efter Somogyis Metode:
V2 cc Plasma afpipetteres i et lille Centrifugeglas, der tilsættes 1 cc destilleret Vand, V2 cc 10 pCt. ZnS04 og Vs cc 0,5 n NaOH. Efter hver Tilsætning Omrystning. Centrifugering i ca. 5 Minutter ved 3000 Omdr. i Min. Det proteinfri Plasma fortyndes eventuelt med destilleret Vand, saaledes at Inulinkoncentrationen ligger mellem 5 og 30 mg pCt. Inulin.
I et Analyseglas afpipetteres V2 cc af det proteinfri og eventuelt fortyndede Plasma, og der tilsættes Diphenylaminreagens til Mærket.
Tilpropning og Kogning paa Vandbad i 40 Minutter. Afkøling paa Vand-bad til Rumfang 10,5 cc og derefter Kolorimetri. Blodprøven taget før Inulininjektionen behandles som her foreskrevet og anvendes som Blindprøve i Komparatorkuvetten.
Middeltallet af de ved Fotometrien aflæste Extinktioner beregnes.
Naar dette Tal multipliceres med Fortyndingsgraden og Standardkur-vens Hældningskoefficient, faas Inulinkoncentrationen i Plasmaprøven.
De paa denne Maade fundne Inulinkoncentrationer afsættes ad Ordi-naten i et Koordinatsystem, medens Tiden afsættes ad Abcissen, og Kurven for Inulinkoncentrationen i Plasmaet kan tegnes. I Fig. 3 er vist en Udskillelseskurve for en Hund med normal Nyrefunktion. Naar Kurven for Plasmakoncentrationen er tegnet, indtegnes Clearancepe-rioderne i Koordinatsystemet, og Middelkoncentrationen i Clearance-perioden beregnes.
Undersøgelse af Urinprøverne.
Før Undersøgelsen fortyndes den allerede ved Blæreskylningen for-tyndede Urinprøve yderligere med destilleret Vand, saaledes at Inulin-koncentrationen ligger mellem 3 og 30 mg pCt. Inulin. Undersøgelsen
4
50
foretages derefter, som beskrevet under Bestemmelser af Standard-kurven.
Naar Diuresens Størrelse, Plasmakoncentrationen og Urinkoncen-trationen kendes, beregnes Glearance efter Formlen.
Kreatininbestemmelse.
Kreatinin blev bestemt efter Folins Metode (34). Denne Metode bygger paa, at Pikrinsyre og Kreatinin ved Tilsætning af NaOH giver en brun Farve, hvis Intensitet er proportional med Kreatininmængden.
Reagenser:
Der blev anvendt samme Proteinfældning som til Jodanalyserne (se disse).
Pikrinsyrereagens:
A. Mættet Pikrinsyre. (Pikrinsyre renset ved Omkrystallisation i 50 pCt. Alkohol).
B. 10 pCt. Natriumhydroxydopløsning.
Umiddelbart før Brugen blandes 5 Dele af A med 1 Del B.
Analyser af Plasmafiltratet: 6 ml af det klare Filtrat overføres i et Reagensglas, som Blindværdi benyttes 6 cc destilleret Vand. Glas-sene tilsættes 3 cc Pikrinsyreblanding, og Indholdet blandes, GlasGlas-sene stilles paa Vandbad ved 25 ° G. i 10 Minutter. Farveintensiteten af-læses overfor Blindprøven i et Pulfrich-Fotometer. Der benyttes 2 cm Cuvette og Filter S. 50.
Analyse af Urinprøver: Urinen fortyndes i Forholdet 1 : 100. 6 cc af Fortyndingen udtages til Analyse. Denne udføres som for Plasma-filtratet.
Standardkurve: Der fremstilles Kreatininopløsninger indeholdende 2, 6, 10 og 14 mg pCt. Kreatinin. Disse analyseredes efter ovenstaaende Maade, og Analyseresultaterne blev afsat i et Koordinatsystem, Fig. 8.
Shannon og Fisher (136) angiver, at høje Glukosekoncentrationer vil genere Kreatininbestemmelsen med Pikrinsyrereagenset; de kommer udover denne Vanskelighed ved at arbejde med Plasmakreatininkoncen-trationer paa 30—40 mg pCt. og foretager Aflæsning 101—14 Minutter efter Tilsætning af Pikrinsyreblandingen til Filtratet. Jeg har foretaget Kreatininanalyser paa Plasmaprøver tilsat Kreatinin, saaledes at
Pias-5 1
£
mg% Kreatinin.
Fig. 8. K r e a t i n i n S t a n d a r d k u r v e .
makoncentrationen var ca. 5 mg pCt. Ved Tilsætning af varierende Glukosemængder, saaledes at Plasmakoncentrationen af dette var fra 200—600 mg pCt., fandt jeg, at Kreatininbestemmelsen efter oven-nævnte Analysemetode ikke paavirkedes af Glukosekoncentrationen.
6*
52
Jodbestemmelse.
I de tidligere nævnte amerikanske Arbejder over Clearance med jodholdige Kontraststoffer er der til Jodbestemmelserne anvendt flere forskellige Metoder, af hvilke skal nævnes Kendalls (72) og Leiperts (77). Begge disse Metoder kræver et ret betydeligt Apparatur og er desuden ret tidsrøvende. Jeg har forsøgt at anvende den af Hojer (64) angivne Metode, efter hvilken Forbrændinger af det Organisk bundne Jod foregaar i alkalisk Medium dels paa aaben Digel (Sandbad) og dels i lukket Forbrændingsrør. Af Gløderesten extraheres Jodet med 96 pCt. Alkohol. Denne Metode er udmærket anvendelig ved lave Jod-koncentrationer i Plasma, men uanvendelig ved højere Jodkoncentra-tioner, idet Extraktionen med Alkohol meget let bliver ufuldstændig.
Metoden er dog meget tidsrøvende.
I 1940 publicerede White og Rolf (176) en Metode til Bestemmelse af Jod i Plasma og Urin. Metoden er netop beregnet paa Jodbestem-melse i Tilslutning til Diodrastclearance. Metodens Princip er følgende.
Ved en vaad Forbrænding af det organisk bundne Jod med Kalium-permanganat i svovlsur Vædske iltes det tilstedeværende Jod til Jodat.
Overskud af Kaliumpermanganat fjernes med Natriumnitrit. Vædsken bliver herefter vandklar og farveløs. Overskud af Natriumnitrit fjernes ved Tilsætning af Urinstof, herved frigøres Kvælstof. Ved Tilsætning af Kaliumjodid til denne Opløsning frigøres Jod. Efter Tilsætning af Stivelse foretages Titreringer med Natriumthiosulfat.
Denne Analysemetode kan ikke anvendes til proteinholdige Opløs-ninger. For Plasmaets Vedkommende er det nødvendigt først at fjerne Proteinstofferne og efter Filtrering foretage Analysen paa Filtratet.
Til Fældning af Proteinstofferne er af White og Rolf (176), Hilden (59) og Christensen (15) anvendt Trichloreddikesyre. En Del af det organisk bundne Jod vil imidlertid udfældes med Proteinpræcipitaterne. Ved Undersøgelse af Plasma med kendt Jodindhold fandt White og Rolf 84,6 pCt, af Jodet i Filtratet. I et senere Arbejde fandt samme For-fattere 86,9 pCt. Hilden fandt 87 pCt. af det beregnede Jod og Chri-stensen 84,0 pCt. Sidstnævnte viste, at »Recovery« var uafhængig af Jodkoncentrationen i Plasmaet. Om den Mængde Jod, der udfældes, staar i Relation til Plasmaets Proteinindhold eller til Albumin-Globulin-indholdet, er endnu ukendt. Jeg har forsøgt at anvende Metoden, men har ikke kunnet opnaa tilfredsstillende Resultater med den.
53
White og Rolfs Metode er senere blevet modificeret af Bak, Brun og Raaschou (5). Disse anvender Proteinfældning med Natrium-wolframat (Folin-Wu's Proteinfældningsmetode) og har iøvrigt modi-ficeret Metoden saaledes, at det er muligt at naa tilfredsstillende Resul-tater med denne.
Analysemetoden.
Reagenser:
10 pCt. Natriumwolframat.
— Svovlsyre.
12
Mættet Kaliumpermanganatopløsning (6,32 g KMnC>4 ad 100 cc Vand).
4 m Svovlsyre.
5 m Urinstof opløsning (30 g GO(NH2)2 ad 100 cc Vand).
Kaliumjodidopløsning (2 g K J i 3 cc Vand, fremstilles frisk til hver* Gang).
2 pro mille Stivelseopløsning.
0,0025 n Natriumthiosulfatopløsning (0,068 g pr. 1 Vand, denne .stabiliseres ved Tilsætning af 10 cg Hg(CN)2 pr. Litef.
Thiosulfatens Titer bestemmes ved at indstille denne overfor en Kaliumjodatopløsning med kendt Normali-tet.
Undersøgelse af Plasma: 1 cc Plasma afpipetteres i et Centrifuge-glas, der tilsættes 1 cc 10 pCt. Natriumwolframat og 8 cc — Svovlsyre, n Oprystning og Centrifugering. 3 cc af Centrifugatet afpipetteres i et Reagensglas, der tilsættes 0,3 cc mættet Kaliumpermanganatopløsning, (undgaa at noget af dette kommer paa Glassets Vægge). Forsigtig Om-rystning. Derefter tilsættes 0,1 cc 4 m Svovlsyre. Glasset anbringes i kogende Vandbad i 12 Minutter. Derefter tilsættes 0,4 cc 1 m Natrium-nitrit, (undgaa at dette drypper ned paa Glassets Sider). Forsigtig Omrystning indtil alt Brunsten er forsvundet, om dette er sket ses bedst ved at holde Glasset op mod Lyset. Der tilsættes 1 cc 5 m Urinstof, kraftig Omrystning og kogende Vandbad, indtil der ikke længere fin-der Luftudvikling (N2) Sted. Dette varer ca. 4 Minutter, det er nød-vendigt at ryste Glassene hvert halve Minut. Efter Afkøling til ca.
54
10 ° C. paa Vandbad tilsættes 0,1 cc Kaliumjodidopløsning og 0,5 cc Stivelseopløsning. Derefter Titrering med Natriumthiosulfat. Ved Titre-ringen maa det tilraades at holde et Reagensglas af samme Størrelse fyldt med destilleret Vand ved Siden af det Glas, hvori der titreres, da det er vanskeligt at se Omslaget fra den svagt blaa Farve til Farve-løshed.
Med denne Analysemetode har Bak, Brun og Raaschou (5) ved Undersøgelse af Plasmaprøver med kendt Jodindhold fundet »Recovery«
varierende fra 87 pCt. til 94 pCt. af det beregnede. Gennemsnitligt 90 pCt. Ved Undersøgelser af Hundeplasma tilsat Perabrodil eller Hip-podin fandt jeg efter ovenstaaende Analysemetode »Recovery« varieren-de fra 87 til 90 pCt. Gennemsnitlig 88 pCt.
Undersøgelse af Urin: Den ved Blæreudskylningen allerede fortyn-dede Urinprøve fortyndes i Forholdet 1 :400. Analysen udføres paa 3 cc af Fortyndingen.
«
Aminosyrebestemmelse.
Bestemmelsen af Aminosyrekoncentrationen i Blod blev foretaget dels efter Folins Metode (35) og dels efter en Metode, hvor de af Da-nielson (23) og Sahyun (124) indførte Modifikationer af Folins Metode var samarbejdede. Folins Metode er baseret paa, at |S-Naftokinonsulfon-syre med Amino|S-Naftokinonsulfon-syrer i alkalisk Vædske giver en rødbrun Farvereak-tion, hvis Intensitet er proportional med Aminosyrekoncentrationen.
Overskuddet af Naftokinonreagenset afbleges efter Folin og efter Sahyun med Natriumthiosulfat i eddikesur Vædske. Denne »ning« er imidlertid ikke fuldstændig. Banielson (23) anvendte Afbleg-ning med Natriumthiosulfat i saltsur Vædske, hvor AfblegAfbleg-ningen bliver mere fuldstændig. Da Thiosulfaten i den saltsure Vædske spaltes under Frigørelse af Svovl, tilsatte Banielson Formaldehyd til Opløsningen, hvorved Spaltningen af Thiosulfaten nedsættes saa stærkt, at Vædsken holder sig klar i flere Timer. Det er imildertid nødvendigt at have Eddikesyre i Opløsningen, da der ellers fremkommer skyede Udfæld-ninger af Aminosyren Tryptofan. Folin og Danielsdn lader Reaktionen mellem Aminosyren og Naftokinonreagenset forløbe ved Stuetempera-tur, hvorfor Glassene henstaar i 24 Timer. Sahyun (124) opvarmer Naftokinonsulfonsyre-Aminosyreblandingen paa kogende Vandbad i ca.
3 Minutter.
55
Jeg har samarbejdet disse Metoder og fundet tilfredsstillende Re-sultater herved.
Reagenser:
0,1 n NaOH.
0,25 pCt. Fenolftalein.
2 pCt. Natriumborat.
0,5 pCt. naftokinonsulfonsurt Natrium.
4 pCt. Natriumthiosulfat.
1,5 n Saltsyre.
Iseddike.
0,15 mol. Formalin.
Syre-Formaldehydopløsning (fremstilles ved at blande 3 Vol.
1,5 n Saltsyre med 1 Vol. Iseddike og 4 Vol. 0,15 mol. Forma-lin. Denne sidste kan fremstilles af 40 pCt. Formaldehyd-opløsning ved at fortynde 11,3 cc af denne til 1000 cc).
Fældningen af Plasmaets Proteinstoffer foretages efter Folin-Wu's Metode (se Jodbestemmelse).
Analyse: 5 cc Filtrat overføres i et Reagensglas. Der tilsættes 1 Draabe Fenolftaleinreagens og Natriumhydroxyd draabevis til vedva-rende lyserød Farve. Derefter tilsættes 1 ml Natriumborat og 1 ml af frisk fremstillet Naftokinonreagens. Bland ved Rotation. Kogning i Vandbad i 3 Minutter. Afkøling i rindende Vand til Stuetemperatur.
Efter Afkøling tilsættes 1 cc Syre-Formaldehydblanding og 1 cc Thio-sulfatopløsning. Indholdet føres kvantitativt over i en 50 cc Maale-kolbe og fortyndes til Mærket med destilleret Vand. Omrystning. Aflæs-ningen foretages i Pulfrich Fotometer, der benyttes 2 cm Kuvette og Filter S. 43; eller i Colemans spectrofotometriske Kolorimeter, der bru-ges Kuvette 6-302 og A 430. Alle Prøver udføres som Dobbeltprøver (og-saa Blindprøven) og alle aflæses overfor destilleret Vand. Den til Amino-syreindholdet svarende Extinction faas som Differens mellem Blind-prøven og BlodBlind-prøvens (AminosyreBlind-prøvens) Middelextinctioner.
Standardkurve: Glycin og Glutaminsyre tørres i Exsiccator til kon-stant Vægt. Der afvejes 534 mg Glycin, der opløses i 500 cc 0,07 n Salt-syre tilsat 0,2 pCt. Natriumbenzoat som Stabilisator. 1050 mg Gluta-minsyre opløses paa samme Maade, hver af disse Opløsninger
Standardkurve: Glycin og Glutaminsyre tørres i Exsiccator til kon-stant Vægt. Der afvejes 534 mg Glycin, der opløses i 500 cc 0,07 n Salt-syre tilsat 0,2 pCt. Natriumbenzoat som Stabilisator. 1050 mg Gluta-minsyre opløses paa samme Maade, hver af disse Opløsninger