Hvordan kan vi bruge DNA -

(1)

DNA fingeraftryk:

Hvordan kan vi bruge DNA - baserede metoder ved

drikkevandsforureninger?

Anna Krestine Nørgaard Teknologisk Institut

(2)

INTRODUKTION

 Teknologisk Institut;

- Hvem er vi?!

 Anvendte metoder

 Molekylærbiologiske metoder anvendt til kildesporing

 Cases:

– Fækal forurening af drikkevand – Coliforme bakterier i drikkevand

 Spørgsmål

(3)

TEKNOLOGISK INSTITUT

 Taastrup, Roskilde, Kolding, Århus og Hirtshals

 Arbejdsområder: Rådgivning, kurser og validering/vurdering og laboratorieaktiviteter

(4)

Life Science

 Fiskeri- og Miljøteknologi

 Kemi- og Bioteknik

 DTI Oil & Gas

 Kemisk og Mikrobiologisk Laboratorium

(5)

MIKROBIOLOGISK LABORATORIUM

 Etableret i 2006

 Primært et udviklings laboratorium

 Udfører kommercielt analysearbejde samt F&U

 Fem laboranter, to biokemikere, en mikrobiolog

 Arbejder på at blive DANAK akkrediteret i løbet af 2010

(6)

MIKROBIOLOGISK LABORATORIUM

Anvendte metoder:

Mikroskopi - DAPI

- FISH – probe specifik (EUB, SRB, ARCH) PCR

- End point PCR - qPCR

Kloning og sekvensering Dyrkning

- Patogene bakterier (H.pylori, S.aureus) , drikkevand, og fødevarer

(7)

Mikrobiologiens historie Tidslinje…

1950 2000 1900

Koleraepidemier Bakterier opdaget

Kimtal og coliforme bakterier

Spildevandsrensning

Penicillin

DNA koden knækket

DNA-baserede metoder

Menneskets genom og kloning

(8)

Molekylærbiologiske metoder anvendt til kildesporing i forurenet drikkevand

Almindelig overvågning

Forureningens alvor

DNA-identifikation

Kan det bekræfte eller afkræfte mistanke om specifik forurening Coliforme til stede

Forhøjet kimtal 22ºC eller 37ºC

Kildesporing

E. coli eller enterokokker

til stede

Fækal kildesporing

? ?

?

? Hvem er synderen?

?

(9)

Identifikation af bakterien (navn)

Coliform identifikation

(10)

Undersøgelse af kimtalsbakterier

1 2 3 4 4 4 5 5 5 66 6 7 7 7 88 8

DGGE-analyse af bakterier fra kimtals-plader. De lodrette ”stiger” repræsenterer prøverne markeret med hvert sit nummer og hver af de vandrette bånd repræsenterer en bakterieart.

Det er markeret med farver, hvilke bakterier eller bakteriergrupper, der findes i flere prøver.

DNA ekstraktion

PCR (opformering af DNA)

Fingerprint-analyse (DGGE)

Identifikation af bånd

Eksempel fra en vandforsyning i Danmark:

Konklusion: Der er 2 (3) kilder til forurening.

-kan vælge at gå videre og identificere arter..

(11)

Undersøgelse af kimtalsbakterier

Acidovorax sp.(1 og 3)

Acodovorax sp.*2 (1 og 3)

Dechloromonas sp. (2)

Acidovorax sp.(3)

Aquabacterium parvum (4)

Aquabacterium sp.(4)

Aquabacterium sp. (4 og 6) Aquabacterium sp. (4) Delftia sp.(6)

1 2 3 4 4 4 5 5 5 66 6 7 7 7 88 8

Identifikation:

Konklusioner:

12 bånd identificeret- 9 forskellige bakterier

Prøve 1 og 3 : Azidovorax, kan stamme fra det omgivende miljø muligt kimtal stammer fra indtrængende jord eller vand

•Prøve 4 og 6 : Aquabacterium, biofilm i drikkevandssysteme muligt kimtal stammer fra en biofilm i systemet.

•Prøve 2 :Dechloromonas, kendt for at kunne nedbryde svært-nedbrydelige organiske forbindelser (fx benzen og perchlorat) Denne prøve var taget nær benzintank!

(12)

Kildespecifikke indikatorer - Bacteroides

?

? ?

?

(13)

Kildesporing af bakterier

Human

Kvæg

Fugle

(14)

Fækalt fingeraftryk

+ + + + + ÷

Human fækal kildesporingsmarkør

(15)

Aarhus 2002

(16)

Køge 2007

(17)

Standardmetoder

E. coli til

stede

(18)

Almindelige stikprøver

Store prøver (25 L)

Toppen af isbjerget

(19)

Case: Fækalkildesporing vha. Bacteriodes

(20)

Kort over Køge

 ca. 7.000 forbrugere

 100 småindustrier

 16 større

industrivirksomheder

 140 registrerede sygdomstilfælde

 110 inden for den ”Røde

zone”

(21)

Prøvested E. coli

(per 100 mL^-1)

Bacteroides

(per 100 mL^-1)

Human fækalmarkør

RA1 >200 10⁶ +

RA2 >200 10⁶ +

RA3 >200 10⁵ +

Husstande i

nordlige Køge 9-19 10³-10⁴ +

Tekniskvand på Køge

renseanlæg

- 10⁷ +

Typisk

spildevand ~10⁶ ~10⁸-10⁹ +

Typisk

drikkevand Ikke målbart Ikke målbart -

Case: Fækalkildesporing vha. Bacteriodes

(22)

Identifikation af coliforme bakterier

 Projekt i samarbejde med BLST

 Database over coliforme bakterier i dansk drikkevand

 Er det de almindeligt forekommende?

 Er de det samme coliforme som dukke op?

– tid (ny forurening) – sted (forskellig kilder)

 Indikerer bakterier en sundhedsmæssig risiko?

 Kan det bekræfte eller afkræfte mistanken om…

 Passer profilen med en bestemt kilde

(23)

Case: Coliforme bakterier i en vandværksforsyning

Vandværk Boring 1

Boring 2

Boring 3

(24)

Vandværk Boring 1

Boring 2

Boring 3

B

A B

Case: Coliforme bakterier i vandværksforsyning

(25)

Supplement til standardmetoder

DNA-baserede metoder Almindelige prøver

(100 mL)

Store prøver (10-100 L) Standardanalyser

 Bevar bevismaterialet

 Udtag prøver med det samme

(26)

Hvad kan de molekylærbiologisk metoder?

 Hurtigt

 Understøttede standard analysere

 Identificeret ”kildetype”

 Dokumentere kilden

(27)

Kontakt Vandgruppen ved Teknologisk Institut

 Lotte Bjerrum Friis-Holm (LBFH)

 lotte.bjerrum.friis.holm@teknologisk.dk

 7220 1837

 Trine-Maria Riis Damgaard (TMRD)

 trine.damgaard@teknologisk.dk

 7220 1864

 Anna Krestine Nørgaard (AKND)

 anna.krestine.norgaard@teknologisk.dk

 7220 2195