n svampeflora under markforhold fungicider på jordens Effekt af sprøjtning med

Effekt af sprøjtning med fungicider på jordens

svampeflora under markforhold

Susanne Elmholt

Analyselaboratoriet for Pesticider Flakkebjerg

Tidsskrift for Planteavls Specialserie

n ^{Statens _} Beretning nr. S 1935,1988

Effekt af sprøjtning med fungicider på jordens

svampeflora under markforhold

Susanne Elmholt

Analyselaboratoriet for Pesticider Flakkebjerg

Tidsskrift for Planteavls Specialserie

n ^{Statens _} Beretning nr. S 1935,1988

- 3 -

INDHOLDSFORTEGNELSE Side

FORORD ... 5

1. INDLEDNING ... 6

1.1 M E T O D E R T I L U N D E R S Ø G E L S E AF P E S T I C I DEFFEKTER PA JORDENS MIKROORGANISMER ... 6

1.2 TIDLIGERE UNDERSØGELSER ... 9

1.3 FORMAL ... 12

2. METODIK ... 15

2.1 MARKFORSØG I VÅRBYG ... 15

2.2 MARKFORSØG I VINTERHVEDE ... 16

2.3 METEOROLOGISKE OBSERVATIONER OG JORDBUNDSANALYSER --- 17

2.4 AFSÆTNING AF SPRØJTEVÆSKE ... 18

2.5 UDTAGNING AF J O R D P R Ø V E R ... 18

2.6 ISOLERING AF JORDSVAMPE (jordvask) ... 21

2.6.1 Generel metodebeskrivelse ... 21

2.6.2 Metodeforsøg ... 21

2.6.2.1 Svampeflora i parallelt udtagede jordprøver ... 21

2.6.2.2 Svampeflora i jordprøver, udtaget i forskellig dybde . 22 2.6.2.3 Svampeflora på organiske og mineralske partikler ... 22

2.6.2.4 Svampeflora på partikler af forskellig størrelse ... 24

2.6.3 Effekt af behandling med TILT 250EC på isolering af jordsvampe (markforsøg i vårbyg) ... 2 4 2.6.4 Effekt af behandling med TILT 250EC på isolering af jordsvampe (markforsøg i vinterhvede) ... 2 4 2.7 ISOLERING AF JORDSVAMPE (pladespredning) ... 2 4 2.7.1 Effekt af behandling m e d TILT 250EC på isolering af jordsvampe (markforsøg i vinterhvede) ... 24

2.8 IDENTIFIKATION AF JORDSVAMPE ... 25

2.8.1 Jordvask ... 25

2.8.2 Pladespredning ... 26

2.9 EFFEKT AF BEHANDLING MED TILT 250EC PA DEN MIKROBIELLE RESPIRATION I JORDPRØVER, UDTAGET FRA MARKFORSØG I VINTERHVEDE ... ... 26

2.10 STATISTISK RESULTATBEHANDLING ... 27

1

- 4 -

3. RESULTATER ... 2 8 3.1 MARKFORSØG I VÅRBYG ... 2 8 3.2 MARKFORSØG I VINTERHVEDE ... 2 9

3.3 AFSÆTNING AF SPRØJTEVÆSKE ... 31

3.4 ISOLERING AF JORDSVAMPE ... 31

3.4.1 Metodeforsøg (jordvask) ... 31

3.4.1.1 Svampeflora i parallelt udtagede jordprøver ... 31

3.4.1.2 Svampeflora i jordprøver, udtaget i forskellig dybde . 33 3.4.1.3 Svampeflora på organiske og mineralske partikler ... 33

3.4.1.4 Svampeflora på partikler af forskellig størrelse ... 36

3.5 EFFEKT AF BEHANDLING MED TILT 250EC I VÅRBYG PA JORD­ S V A M P E 36 3.6 EFFEKT AF BEHANDLING MED TILT 250EC I VINTERHVEDE PA J O R D S V A M P E ... 37

3.6.1 Jordvask ... 37

3.6.2 Pladespredning ... 46

3.6.3 Mikrobiel respiration ... 57

4. DISKUSSION ... 67

4.1 METODEVALG ... 6 7 4.1.1 Mikrobiel respiration ... ... 67

4.1.2 Isolering af jordsvampe ... 68 4.1.2.1 Pladespredning ... 70

4.1.2.2 Jordvask ... 71

4.2 RISIKO FOR DIREKTE EFFEKTER PA JORDENS SVAMPEFLORA VED SPRØJTNING UNDER MARKFORHOLD ... 76

4.3 RISIKO FOR INDIREKTE EFFEKTER PA JORDENS SVAMPEFLORA VED SPRØJTNING UNDER MARKFORHOLD ... 7 7 4.3.1 Effekt på planternes overjordiske dele ... 77

4.3.2 Naturlige stresseffekter ... 81

4.4 EFFEKT PA JORDENS SVAMPEFLORA VED BEHANDLING MED TILT 250EC UNDER MARKFORHOLD ... 82

K O N K L U S I O N ... 85

ERKENDTLIGHED ... 87

SAMMENDRAG ... 88 S U M M A R Y ... 8 9 REFERENCELISTE ... ... 91

Appendix 1 Meteorologiske observationer m.v.

Appendix 2 Substrater m.v.

Appendix 3 Autornavne for identificerede svampe Appendix 4 Metodeforsøg m.v. (jordvask)

Appendix 5 Statistisk behandling af resultater af jordvask Appendix 6 Gennemsnitsresultater samt statistisk behandling

af resultater af pladespredning

- 5 -

FORORD

I perioden fra 1981 til 1985 steg det årlige fungicidforbrug i landbruget i Danmark fra 1094 tons til 2199 tons virkstof. I samme tidsrum steg behandlingshyppigheden fra 0,3 til 1,0 fungi­

cidbehandlinger/ha (Kjølholt, 1986). Blandt årsagerne er en stig­

ning i arealet med vintersæd (hvede og rug), som i 1984-1985 var 454.000 ha mod 191.000 ha i 1 980-1981 (Landbrugsst a t i st ikken, 1981 & 1985). Desuden er der markedsført et antal meget effek­

tive, systemiske fungicider (ergosterolhæmmere), som kan medføre en udbyttestigning, selv ved profylaktisk sprøjtning hvor der ikke er synlige sygdomsangreb på planten.

Det store f o r b r u g af f u n g i c i d e r kan ses som et led i den generelle stigning i pesticidforbruget, som har fundet sted siden midten af dette århundrede. Fungicider fremstilles for at nedsætte svampeangreb, men det ideelle kriterium "at et fungicid selektivt bør destruere eller h æ m m e patogene svampe, når det anvendes i koncentrationer, som ikke påvirker andre mikroorganis­

mer i jorden" er et uopnåeligt mål, fordi de cellulære processer, fungicidet rammer, er fælles for de fleste svampe. I de'nne s a m ­ menhæng er det vigtigt at fastslå, at plantepatogene svampe kun

repræsenterer en meget lille del af det totale antal arter af svampe, som skønnes at ligge m e l l e m 100.000 og 250.000. Blandt disse er kun 10 0 arter almindelige og alvorlige plantepatogener (Smith & Pugh, 1984). Dvs. at mere end 99,9% af alle kendte arter af svampe ikke gør skade på planter. Mange svampe er derimod vigtige i forbindelse med omsætning af organisk materiale, opret­

holdelse af en god jordstruktur og som konkurrenter over for skadevoldende organismer (Elmholt, 1986a).

I den forliggende Specialberetning (S 1935) beskrives resultater af et 2-årigt projekt til belysning af fun.giciders effekt på jordens svampeflora under markforhold. Projektet er financieret af SJVF og Statens Planteavlsforsøg og udført ved Analyselabora­

toriet for Pesticider i Flakkebjerg.

- 6 -

1. INDLEDNING

1.1 M E T O D E R T I L U N D E R S Ø G E L S E AF P E S T I C I D E F F E K T E R PA J O R D E N S MIKROORGANISMER

Den enkleste f r emgangsmåde til måling af pesticideffekter på jordens mikroorganismer er at måle væksthastighed af renkulturer (bakterier eller svampe) på faste næringssubstrater, tilsat forskellige doser af det undersøgte pesticid. Sådanne tests er billige, hurtige og har en god reproducerbarhed (dvs. de kan gentages i s a m m e eller andre laboratorier med tilsvarende re­

sultat). Forsøg med renkulturer viser, at fx. et fungicid som benomyl virker meget forskelligt på forskellige arter af svampe (Edgington sX al.. 1971). På grundlag af resultater med ren­

kulturer er det dog vanskeligt at udlede noget om en eventuel effekt på de samme mikroorganismer i jord, idet mikroorganismer i jord påvirkes af såvel samspillet mellem forskellige arter som mellem individerne indbyrdes. Desuden er pesticidets tilgængelig­

hed i jord ofte langt mindre end i renkulturer pga. nedbrydning og/eller binding til jordpartikler.

Undersøgelser af effekter på mikroorganismer i jord kan foretages som markforsøg eller laboratorieforsøg. I laboratorieforsøg h j e m ­ tages og sigtes jordprøverne, og pesticidet tilføres under kon­

trollerede temperatur-, beluftnings- og fugtighedsforhold. Forsø­

gene udføres uden plantedække. Laboratorieforsøg er generelt enkle at udføre og har en god reproducerbarhed. I markforsøg pesticidbehandles jorden under naturlige forhold. Markforsøg er meget vanskelige at standardisere, bl.a. fordi forhold som klima og plantedække har stor indflydelse på resultaterne (Cook &

Greaves, 1987) .

Både ved markforsøg og ved laboratorieforsøg fås en jordprøve, hvori det skal undersøges, om mikroorganismerne er blevet påvir­

ket af pesticidbehandlingen. I litteraturen foreligger et stort antal sammenlignende forsøg samt vurderinger af, hvilke parametre

- 7 -

og a n a l y s e m e t o d e r , der egner sig bedst til at undersøge p e s t i ­ cideffekter på mikroorganismer (Grossbard, 197 0; Atlas et al..

1978; Greaves et al.. 1978; Malkomes & WÖhler, 1983; Zelles £t al.. 1986 ; Somerville & Greaves, 1987). Oversigtsartikler på dansk findes i Elmholt (1986a) og Elmholt & Helweg (1987).

De parametre, som undersøges, kan inddeles i "funktionelle" og

"strukturelle". Funktionelle parametre beskriver mikrobiel akti­

vitet (respiration, omsætning af organiske materialer, e n z y m ­ aktivitet m.m.). Strukturelle parametre beskriver m i k r o o r g a n i s ­ mernes sammensætning (populationsundersøgelser).

Det har siden starten af 70'erne været diskuteret, hvordan man i forbindelse med markedsføring af pesticider kan sikre sig mod skader på jordens mikroorganismer og dermed på den aktivitet, som skal foregå i jorden. I perioden 1973 til 1985 er der afholdt en række europæiske konferencer om måling og evaluering af pestici­

ders effekter på ikke-skadelige mikroorganismer i jord med delta­

gelse af folk fra forskningsinstitutioner, kemikaliefirmaer og miljømyndigheder. På grundlag heraf er der udarbejdet rapporter over de mest velegnede parametre til rutinemæssige undersøgelser (Greaves £t ål^., 1 980 ; S o m e r v i l l e £t å-Lt., 1 985). Med L o v ­ bekendtgørelse nr. 574 om Lov nr. 212 om kemiske stoffer og produkter (1987) og Bekendtgørelse nr. 791 om kemiske bekæmpel­

sesmidler (1987) følger de danske miljømyndigheder disse a n b e ­ falinger, idet der stilles krav til producenter eller importører af bekæmpelsesmidler om at undersøge utilsigtede mikrobielle miljøeffekter, inden et middel godkendes i Danmark. Undersøgel­

serne skal foretages i laboratorieforsøg og skal omfatte effekter på mikrobiel aktivitet i jorden (respiration og kvælstof o m s æ t ­ ning, eventuelt kvælstofbinding og nedbrydning af halm).

Ved vurdering af målte pesticideffekters betydning bør man tage hensyn til, at m i k roorganismer i naturén er udsat for en lang række h æ m m e n de og stimulerende effekter (Domsch £t aj^., 1983).

Disse påvirkninger kan for eksempel skyldes ændringer i t e m p e ­

ratur, vandindhold, pH, CO2, O2 og næringsstoffer eller forekomst af prædatorer, antagonister o.l. Med udgangspunkt i den g e n ­ nemsnitlige størrelsesorden og varighed af effekter, som skyldes disse såkaldte "naturlige stresspåvirkninger'' foreslår Domsch et al. (1983), at pesticideffekter opdeles i "ubetydelige" (varighed

<30 dage), "tolerable" (varighed >30 dage, men <60 dage) og

“kritiske" (varighed >60 dage). En målestok som denne er meget forenklet, men understreger tidsfaktorens helt afgørende betyd­

ning ved vurdering af målte pesticideffekter.

Der er blandt jordbundsmikrobiologer, især i USA (se Levin & K i m ­ ball, 1984), en udtalt skepsis over for de metoder, som anvendes (hvilket også fremgår af de mange metodestudier, som beskrives i litteraturen, jvf. ovenfor). Man nærer frygt for, at pesticidan­

vendelsen kan vise sig at påvirke jordens dyrkningsværdi på længere sigt, til trods for at de krav, som stilles ved godken­

delse af midlerne, efterkommes. Det skyldes for det første, at målemetoderne er behæftet med en ganske stor usikkerhed, og for det andet et meget væsentligt faktum, nemlig at vores viden om mikrobiel økologi endnu er så mangelfuld, at det er vanskeligt at vurdere målte effekters betydning. S o merville £t al. (1985) udtrykker det på følgende måde: “Forskningen bør rettes mod en forbedret evne til at identificere, kvantificere og evaluere potentielt skadelige effekter ved brug af pesticider på den mikrobielle aktivitet. Basisforskning er den eneste måde, hvorpå vi kan erhverve den viden, som er nødvendig for den anvendte forskning. Især er det påkrævet, at der iværksættes en mer e intensiv forskning mhp. at klarlægge interaktioner mellem p e s ­ ticid, jord, afgrøde og mikroorganismer." En del forskere mener, at pesticideffekter - trods de vanskeligheder, der er forbundet hermed - så vidt muligt bør undersøges i det økosystem, hvor midlet tænkes anvendt, nemlig i marken, eller i simulerede øko­

systemer, hvori der indgår planter (mikrokosmosforsøg) (Levin &

Kimball, 1984).

- 9 -

1.2 TIDLIGERE UNDERSØGELSER

Blandt de første, som blev opmærksomme på, at pesticider kan have uønskede virkninger på jordens mikroorganismer, var danskeren H.L. Jensen. Han iværksatte undersøgelser af flere herbicider

(Jensen, 1962; Jensen, 1963; Jensen, 1964; Jensen, 1969). Dette arbejde er senere videreført på Planteavlslaboratoriet og på Analyselaboratoriet for Pesticider i Flakkebjerg, og har foruden herbicider (Helweg, 1972a; Helweg, 1983a) omfattet insekticider (Helweg, 1972b; Eisenhardt, 1975), fungicider (benomyl, carbenda- zim og iprodion) (Helweg, 1973 ; Wessén £t a l .. 1978; Helweg, 1983b) og pesticidkombinationer (Helweg, 1986). I udlandet er der udført et meget stort antal forsøg med pesticideffekter på jor­

dens mikroorganismer. De er nærmere beskrevet og kommenteret i en række oversigtsartikler (Audus, 1970; Anderson, 1978; Torstens­

son, 1979; Domsch s,t a l .. 1983; Jagnow, 1984; Ingham, 1985;

Malkomes & Wühler, 1983).

Langt de fleste undersøgelser af pesticideffekter på mikroorga­

nismer i jord er foretaget i laboratorieforsøg som undersøgelser af mikrobiel aktivitet. Disse undersøgelser viser generelt, at funktioner som respiration, kvælstofomsætning, enzymaktivitet og omsætning af organisk materiale kun er udsat for svage og forbi­

gående påvirkninger, når pesticider anvendes i realistiske doser (Domsch £t al.. 1983; Elmholt & Helweg, 1987). Som undtagelser fremhæves enkelte jordsteriliseringsmidler og fungicider, som - ikke uventet - kan have en forholdsvis kraftig'effekt selv i små doseringer, og specielt i populationsundersøgelser af fx. svampe, alger eller protozoer (Domsch £t al., 1983).

Oversigtsartikler vedrørende effekter af fungicider findes i Wainwright (1977). Der foreligger kun meget få, tilgængelige undersøgelser, hvor effekter af ergosterolhæmmende fungicider på jordens mikroorganismer er belyst (Smiley & Craven, 1979; Ingham, 1985; Malkomes, 1985; Wendler & Gadkari, 1986; Elmholt & Smede- gaard-Petersen, 1988).

- 10 -

Grundlaget for den foreliggende Specialberetning er et forsøg, hvori undersøgtes, om propiconazol og captafol under markforhold (vårbyg) medførte målelige effekter på sammensætningen af den svampeflora, som kunne isoleres fra jorden (Elmholt, 1985; Elm­

holt & Smedegaard-Petersen, 1988). Propiconazol blev udsprøjtet som 2x 0,5 1 Tilt 250EC/ha, captafol som 5x 2,0 1 Ortho-Difolatan FW/ha. Desuden indgik et ubehandlet kontrolled. Resultaterne viste en stor årstidsvariation i antal af svampe og i sammensæt­

ningen af svampefloraen, hvilket bl.a. skyldtes en forøget fore­

komst af primære, saprotrofe svampe i den sene vækstsæson. Blandt de primære saprotrofe svampe (svampe, som ernærer sig af dødt, organisk materiale) findes de arter, som oprindeligt har befundet sig på bla. blade og stængler. Efter nedvisning af planten og en eventuel opformering på de friske planterester bliver de gradvist erstattet af sekundære saprotrofe svampe, efterhånden som plante­

materialet nedbrydes (Swift, 1976). Blandt primære saprotrofe svampe regnes f.eks. Cladosporium herbarum og Epicocccum purpur- ascens. mens slægter som Penicillium og Trichoderma regnes til de sekundære saprotrofe svampe (Swift, 1976). Inden fungicidbehand­

ling var der ikke signifikant forskel mellem antallet af svampe i de 3 forsøgsled (Elmholt & Smedgaard-Petersen, 1988). I juli blev der totalt isoleret signifikant færre svampe fra de behandlede forsøgsled end fra kontrolforsøget. Forskellene var ikke længere statistisk signifikante 1 måned efter behandling. I følge defini­

tion af Domsch £i .al*. (1983) er en effekt af denne størrelse og varighed "ubetydelig".. Men de isolerede svampe var forskelligt følsomme over for fungicidbehandling: Ingen af svampene blev på­

virket længere end en måned ved behandling med Tilt 250EC, mens både antallet af primære saprotrofe svampe og antallet af Sphae- ropsidales forblev signifikant reduceret i mere end en måned ved behandling med Ortho-Difolatan FW.

Forsøget gav mulighed for at sammenligne svampefloraen i jorden med svampefloraen på de grønne bygblade, som blev undersøgt i samme forsøg. Formålet med at undersøge svampefloraen på bladene var at klarlægge, hvorledes svampenes kvantitative og kvalitative

- 1 1 -

sammensætning på blade af vårbyg ændredes i løbet af vækstsæsonen og hvorledes forskellige fungicider påvirkede den saprofytiske svampeflora, planternes vækst og udbytte (Tolstrup, 1984). Den saprotrofe svampeflora på blade har været genstand for stigende interesse. Fokkema (1981) beskriver, hvorledes disse svampe (Spo- robolomyces spp. (rød gær), Cryptococcus spp. (hvid gær), Aureo- basj,dj,uffl pullulans. Cladosporium spp., Alternaria spp., Epicoccum p u r p urascens m.fl.) har både positiv og negativ betydning for plantens vækst. Den positive indflydelse skyldes antagonisme (primært n æ r i ng s s t o f konkurrence) og h y perparasitisme over for patogene svampe. Blandt de negative effekter er skygning for fotosyntese ved kraftige belægninger af mørke svampe, som Clado­

sporium og Alternaria. samt nedbrydning af voks og kutin, hvilket kan medføre udsivning af næringsstoffer fra planten. Desuden kan saprotrofe svampe fremskynde nedvisning af bladene ved at forsøge indtrængning. Dette udløser aktive forsvarsmekanismer hos plan­

terne og er korreleret til en øget respiration og et nedsat udbytte (Smedegaard-Petersen, 1982).

Resultaterne af jordbundsundersøgelserne pegede i retning af, at en stor del af den målte effekt var indirekte (afspejling af behandlingseffekten på de overjordiske plantedele), sandsynligvis forstærket ved, at jordprøverne blev udtaget i det øversté jord­

lag (0-3 cm): Det skyldtes den store forekomst af primære sapro­

trofe svampe, hvoraf de fleste ikke normalt isoleres så hyppigt fra jord (Domsch, 1960). Det skyldtes endvidere, at resultaterne af de jordbundsmikrobiologiske undersøgelser stemte helt overens med de resultater, som blev opnået ved undersøgelse af de grønne blades flora, idet den samme kraftige effekt på de primære sapro­

trofe svampe blev fundet på grønne blade, især ved behandling ved Ortho-Difolatan FW (Tolstrup, 1984). Disse svampe er derfor muligvis tilført jorden sammen med planterester eller som koni- dier med regn eller ved nedfald. Hvis man skal isolere et repræ­

sentativt udsnit af jordens svampeflora, anbefales en prøvedybde på 10-12 cm i agerjord (Garns & Domsch, 1967), men da udsprøjtede fungicider sjældent trænger mere end et par cm ned i jorden

- 1 2 -

(Anderson, 1978), vil udtagning til denne dybde medføre en kraftig "fortyndning" af en eventuel direkte effekt.

1.3 FORMAL

Formålet med projektet har været at udbygge den forhåndenværende viden om fungiciders effekt på jordens svampeflora under markfor­

hold.

Når mikroorganismer i jorden ved kontakt med sprøjtemiddelrester dræbes eller h æ m m e s i deres vækst tales om en direkte effekt. For at vurdere omfanget af en eventuel direkte effekt var et af projektets formål at undersøge, hvor stor en del af sprøjtevæsken der når ned på jorden under markforhold. Foruden kemiske afsæt­

ningsmålinger valgtes som biologisk mål for en eventuel direkte effekt at bestemme den mikrobielle respiration i jordprøver, som var udtaget i marken efter behandling. Mikrobiel respiration defineres som "optagelse af 0 2 eller udskillelse af CO2 fra bak­

terier, svampe, alger og protozoer i jord" (Anderson, 1982).

Mikrobiel respiration anbefales til rutinemæssige laboratoriefor­

søg ved godkendelse af pesticider netop med den begrundelse, at denne test giver et mål for en eventuel direkte effekt på den mikrobielle aktivitet i jorden (Somerville £t al.. 1985).

For at få et mål for en eventuel indirekte fungicideffekt ved sammenligning af fungicideffekt på afgrødens overjordiske dele med de jordbundsmikrobiologiske resultater undersøgtes svampe­

floraen på friske og nekrotiske blade.

Til at belyse effekten på jordens svampeflora valgtes at under­

søge "det totale antal svampe", der som testparameter kar a k ­ teriseres som middelfølsom over for pesticidpåvirkning (Domsch et al.. 1983). Formålet var var at belyse følgende:

- Kunne det lade sig gøre at påvise en dosisafhængig effekt inden for et realistisk koncentrationsområde?

- 13 -

- Hvor store var pesticideffekterne i sammenligning med de "na­

turlige" svingninger i svampefloraens sammensætning (naturlige stresseffekter)?

Der blev udlagt markforsøg med forskellige fungiciddoseringer og foretaget en så hyppig prøveudtagning som praktisk muligt for at kunne beskrive naturlige stresseffekter. I markforsøgene blev anvendt 1/2x til 1 0x anbefalet dosering.

I praksis kan man ved sprøjteoverlap ofte se en fordobling af doseringen, mens en 1 0-dobling af den anbefalede dosering er utænkelig, når undtages sprøjteuheld. Den for praksis høje dosis er for det første medtaget for at muliggøre en dosis-respons kurve for de jordbundsmikrobiologiske effekter og for det andet, fordi man i retningslinier for undersøgelse af pesticiders miljø­

effekter opererer med "anbefalet dosis" og "1 0x anbefalet dosis"

(Somerville al.. 1985).

Svampene blev, som i foregående forsøg (Elmholt, 1985), isoleret ved pladespredning og jordvask og i muligt omfang identificeret.

Gennem mange år har der været rejst kritik af pladespredning som metode til brug ved undersøgelser af svampe (Chesters, 1949;

Harley, 1971; Pugh, 1980). Kritikken begrundes primært med, at de fleste kolonier, som vokser frem ved pladespredning, stammer fra konidier. En svamps metabolisk aktive stadium er ikke dens koni- dier, men dens mycelium. Bestemmelse af antal svampe i jorden ved pladespredning (soil dilution plate-counting technique) bygger på en metode, der oprindeligt blev udviklet til tælling af bakterie­

kolonier. Siden er metoden også i vid udstrækning anvendt til tælling af svampekolonier, bla. i forbindelse med undersøgelser af fungicideffekter på jordens svampeflora (Hofer et al.. 1971;

Foster & McQueen, 1977; Smiley & Craven, 1979; Smith & Pugh, 1984; Atlas £t al.. 1978; Domsch ål*., 1983).

For at kunne undersøge, hvilke svampe der er metabolisk aktive på et givent tidspunkt, har man forsøgt at udvikle metoder, hvor

- 14 -

svampene isoleres fra hyfer i stedet for konidier. En forholdsvis enkel metode, foreslået af Chesters (1949), anbefaler, at man

"vasker" jorden grundigt for at fjerne konidier og derefter lægger jordpartikler direkte på agar. Denne metode er v i d e r e ­ udviklet og kaldes idag jordvask (soil washing technique) (Wil­

liams £t al.. 1965; Garns & Domsch, 1967). Jordvask er en meget mere arbejdskrævende metode end pladespredning og er bla. derfor kun sjældent anvendt i forbindelse med pesticidundersøgelser (Elmholt, 1985). Det var derfor nødvendigt af foretage enkelte metodeundersøgelser til forbedring af forsøgsteknikken.

- 1 5 -

2. METODIK

Samtlige undersøgelser er foretaget på grundlag af 2 markforsøg, et i vårbyg og et i vinterhvede. Markforsøgene har været placeret på Planteværnscentret i Flakkebjerg.

I begge forsøg valgtes som fungicid Tilt 250EC, hvis aktive ingredient er propiconazol (1- (2-(2,4-dichlorophenyl)-4-propyl- 1 ,3-dioxolan-2-yl-methyl)-1H-1,2,4-tr iazol)). Det sælges som Tilt 250EC, men forhandles idag primært i blanding med andre aktiv­

stoffer. Propiconazol er et systemisk fungicid, dvs. at det kan translokeres i planten. Dets hovedvirkning er en hæmning af ergosterolbiosyntesen i svampe (Schwinn, 1983). Ergosterol, som ikke dannes af planter, anses for at være den vigtigste sterol i de fleste svampe (ikke Oomycetes og Zygomycetes) og en forudsæt­

ning for dannelse af svampenes cellemembran. Propiconazol er et bredspektret fungicid. I den anbefalede dosering på 125 g a.i./ha har det en meg e t god virkning over for obligat patogene svampe (Erysiphe g ram ines og P uccinia spp.) samt en række fakultativt patogene s v a m p e (5^pifixia spp., Biiyiicli(2SEfiiium £ £ c ^ l i s , Drechslera teres og Helminthosporium sativum). Over for Fusarium spp. er effekten variabel. Propiconazol har desuden god virkning over for C l a d o s p o r i u m spp. (Schwinn, 1983; Latham & Hammond, 1983).

2.1 MARKFORSØG I VÅRBYG

Markforsøget blev udlagt som blokforsøg med 4 behandlinger, 7 fællesparceller og tilfældig parcelfordeling. Sædskifte: 1981 Vårbyg. 1982 Vinterhvede. 1983 Vårbyg. 1984 Vårraps. Forsøgsare­

alet var aldrig tidligere behandlet med Tilt. Jorden blev pløjet om efteråret og inden såning fældet og harvet. Arealet blev tilsået den 26/4 1985 med 190 kg (Harry-byg)/ha og gødsket med 435 kg NPK (21:4:10)/ha (nedharvet). Der blev ikke foretaget insekticid- eller herbicidbehandling af arealet. Parcellerne blev håndluget.

- 16 -

Fungicidbehandling med Tilt 250EC blev foretaget den 18/6 på Feekes stadium 8 med en håndbåret sprøjte (Dyse: 4110-16. Ydelse:

1,09 l/min. Tryk: 3 bar. Hastighed: 4,0 km/t).

Forsøgsled 1. Ubehandlet Forsøgsled 2. 0,20 l/ha Forsøgsled 3. 1,00 l/ha Forsøgsled 4. 5,00 l/ha

Forsøget blev høstet den 30/8. Kerneudbyttet blev målt i samtlige parceller, og det gennemsnitlige resultat udregnet.

Til tælling af kolonier af C l a dosporium spp. på de 3 øverste blade blev repræsentativt udtaget 30 kraftige, ensartede, a k s ­ bærende skud fra hvert forsøgsled den 22/7. Antallet af C l a d o ­ spor ium kolonier blev talt på 0,1% maltekstraktagar (Appendix 2) ved hjælp af bladaftryk ("Leaf Print"-metoden) (Tolstrup, 1984).

Antallet af Cladosporium kolonier blev talt under mikroskop på et areal å 0, 3 8 cm 2. Ved stor forekomst var det vanskeligt at f o r e ­ tage en optælling. Det skønnedes, at flere end 25 kolonier pr.

bladstykke ikke lod sig tælle, og disse resultater er registreret som 25. Resultaterne blev beregnet som antal kolonier/cm2 blad­

overflade. På de 3 øverste blade undersøgtes foruden antallet af Cladosporium kolonier også forekomst af øvrige svampe. Til under­

søgelse af bladsvampe på de nedre, nekrotiske blade anvendtes ligeledes bladaftryk (bladstykker ca. 2 cm). Desuden udlagdes 6 cm lange bladprøver, udtaget som ovenfor den 5/8, på fugtet filtrerpapir. Bladstykkerne blev undersøgt under mikroskop.

2.2 MARKFORSØG I VINTERHVEDE

Markforsøget blev udlagt som blokforsøg m e d 3 behandlinger, 6 fællesparceller og systematisk parcelfordeling. Sædskifte: 1982 Vårbyg. 1983 Raps. 1984 Vårbyg. 1985 Ærter. Forsøgsarealet blev i 1984 behandlet med 0,3 1 Tilt 250EC/ha. Jorden blev pløjet og harvet inden såning. Arealet blev tilsået den 26/9 1985 m e d 210 kg (Kraka-hvede)/ha og gødsket den 21/4 1986 med 714 kg NPK (21:4:10)/ha (nedharvet). Der blev foretaget herbicidbehandling

- 17 -

den 17/5 med 3,5 1 Herbaion 620 (MCPA+mechlorprop+clopyralid)/ha og vækstregulering den 13/5 med 1,6 1 Cycocel extra (chlormequat- chlorid+cholinchlorid)/ha. Ingen insekticidbehandling.

Fungicidbehandling med Tilt 250EC blev foretaget første gang den 27/5 på Feekes stadium 6 med traktorbåret sprøjte (Dyse: 4110-16.

Ydelse: 1,09 l/min. Væskemængde: 300 l/ha. Tryk: 3 bar. Hastig­

hed: 4,0 km/t. Sprøjtedouche: Lodret). En tilsvarende sprøjtning blev udført anden gang den 17/6 på Feekes stadium 9. Doseringerne var følgende:

Forsøgsled 1. Ubehandlet + ubehandlet Forsøgsled 2. 0,25 l/ha + 0,25 l/ha Forsøgsled 3. 2,50 l/ha + 2,50 l/ha

Forsøget blev høstet den 4/9. Kerneudbyttet blev målt i 5 af 6 fællesparceller, og det gennemsnitlige resultat udregnet.

Til tælling af kolonier af C l a dosporium spp. på de 3 øverste blade blev repræsentativt udtaget 10 aksbærende skud 5 gange i perioden 24/6-11/8 i een af fællesparcellerne. Antallet af Clado- sporiuin kolonier på bladene blev opgjort, som beskrevet i afsnit 2

.

.

2.3 METEOROLOGISKE OBSERVATIONER OG JORDBUNDSANALYSER

Samtlige meteorologiske observationer er foretaget ved klimasta­

tion 'Flakkebjerg', 100-500 m fra forsøgsarealerne. Vandbalancen er udregnet som nedbør (mm) minus fordampning (mm) fra fri vand­

overflade (evaporimeter HL 315). Den gennemsnitlige l u f t t e m p e ­ ratur ses i Appendix la og d. Nedbøren ses i Appendix 1& og £.

Den gennemsnitlige, ugentlige vandbalance ses i Appendix lc og £.

Jordbundsanalyser er foretaget på Centrallaboratoriet i Foulum i henhold til metodeforskrifter, udarbejdet af Landbrugsministeriet (1972). En beskrivelse af jordtypen fra markforsøg i vårbyg og vinterhvede ses i Appendix I3 og h* I begge tilfælde drejer det sig om lerjorder med humusindhold på m e l l e m 2 og 3% og et C/N

- 1 8 -

forhold på omkring 1 0.

2.4 AFSÆTNING AF SPRØJTEVÆSKE

For at måle afsætning af Tilt 250EC på jorden blev sprøjtevæsken tilsat et fluorescerende sporstof (UVITEX) i mængden 2g/100 ml Tilt 250EC. Ved hjælp af fotofluorometer kan man måle UVITEX- indholdet i sprøjtevæsken og på fx. plantedele og filtrerpapir og omregne resultaterne til ml afsat propiconazol. Som "opsamlere"

er i de foreliggende forsøg anvendt filtrerpapir, fastgjort på petriskåle, som var anbragt på pinde lige over planterne samt på jorden me l l e m rækkerne. Ved markforsøget i vårbyg blev UVITEX tilsat sprøjtevæsken til et af forsøgsleddene, ved markforsøget i vinterhvede til samtlige forsøgsled ved begge sprøjtninger. Ana­

lysemetoden, som er udarbejdet på grundlag af Fischer (1981), er beskrevet i Elmholt (1986b).

2.5 UDTAGNING AF JORDPRØVER

I Figur 2.1 ses det udstyr, som er anvendt til udtagning af jord­

prøver. a viser den type bor, som normalt anvendes til p r ø v e ­ udtagning ved bestemmelse af fysisk/kemiske parametre (Landbrugs­

ministeriet, 1972). Boret er 'slidset op' i ca. 1/3 af omkredsen, hvilket umuliggør udtagning af uforstyrrede jordprøver. Derfor

****************************************************************

Figur 2.1.

Udstyr til udtagning af jordprøver til kemiske og mikrobiologiske undersøgelser, å*. Åbent jordbor (ikke fraktionerede prøver), b*.

Lukket jordbor (fraktionerede pr øver). Skovle (fraktionerede prøver).

Figure 2.1.

Sampling tools for the collection of soil samples for mycological and chemical analyses, a*. Open soil sampler (non-fractionated samples), li*. Closed soil sampler (fractionated samples), Shovels (fractionated samples).

- 19 -

2'

- 20 -

fremstilledes på Analyselaboratoriet et jordbor, hvormed man kan udtage uforstyrrede, fraktionerede prøver til en dybde af 15 cm (£)• Prøven kan drejes ud ved hjælp af et gevind og derefter

"skæres op" i mindre prøver af ønsket længde. Håndvægten giver mulighed for at "stampe" boret ned i jorden om sommeren, hvor agerjorden i tørre perioder er meget hård. Ulempen er, at der sker en sammenpresning af jorden i boret, og at der skal udtages et meget stort antal prøver, hvis der skal være jord til både mikrobiologiske og kemiske analyser. I markforsøget i vinterhvede anvendtes derfor i stedet et system af 2 skovle, hvormed det var muligt med en rimelig arbejdsindsats at udtage forholdsvis store, uforstyrrede jordprøver fra de øverste 2 cm (c).

Udtagning af jordprøver i vårbyg blev foretaget inden fungicidbe­

handling (17/6) og derefter den 21/6, 5/7 og 16/8. Jordprøver blev blandet omhyggeligt og derefter sigtet (maskevidde 2 mm).

Den 17/6 blev der udtaget 40 parallelle jordprøver repræsentativt i forsøgsarealet. Den 21/6 blev 4 prøver fra samtlige parceller sammenblandet til 28 prøver. Den 5/7 og 16/8 blev de 7 prøver fra hvert forsøgsled derpå sammenblandet og delprøver heraf udtaget til jordbundsmikrobiologiske undersøgelser. Prøverne blev udtaget i 0-3 cm, den 5/7 desuden i dybderne 3-5 cm og 5-10 cm, m e d almindeligt jordbor (Figur 2.la). Jordprøver til restkoncen­

trationsbestemmelse af propiconazol blev udtaget 1 / 8 i 0-1, 1-2, 2-3, 3-4 og 4-5 cm's dybde med det bor, som er afbildet i Figur

2

.

.

Udtagning af jordprøver i vinterhvede blev foretaget 10 gange i perioden fra den 22/5 til den 11/8. Der blev udtaget 6 prøver i hver parcel i 5 af fællesparcellerne i dybderne 0-1 cm og 1-2 cm med små skovle (Figur 2.l£). Jordprøverne blev blandet grundigt og sigtet (2 mm). Af de sammensatte jordprøver blev udtaget del­

prøver til mikrobiologiske undersøgelser.

Vandindholdet i jordprøverne blev bestemt for at kunne udregne resultater på basis af tør jord. Dobbeltprøver å ca. 10 g blev

- 2 1 -

afvejet på grovvægt og tørret 1 døgn ved 105°C. Vægttabet blev udregnet i pct. af vådvægt. I Figur 2.2 ses hvorledes jordens vandindhold, bestemt gravimetrisk, varierede i løbet af perioden 22/5 - 11/8 1986. I perioden fra 22/5 til 2/7 var vandprocenten i 1-2 cm ca. 2% højere end i 0-1 cm, dog var de næsten ens den 11/6, hvor vandprocenten var steget med 5% i forhold til fore­

gående prøveudtagning. Bortses fra denne stigning lå vandprocen­

ten i perioden fra 2/6 til 2/7 under 10%, den 2/7 var vandprocen­

ten i øverste cm under 5%. Når undtages den 16/7, hvor v a n d ­ procenten lå m e l l e m 8 og 10%, var der i perioden fra den 9/7 til den 11/8 et forholdsvis ensartet vandindhold i jorden på 13-14% i 0-2 cm's dybde.

2.6 ISOLERING AF JORDSVAMPE (jordvask)

2.6.1 Generel metodebeskrivelse

Jordprøver & 35g blev homogeniseret med 350 ml postevand i 3 minutter på Waring blender ved lav hastighed (8000 o m d r e j n i n ­ ger/minut). I forsøgene blev anvendt sigter med følgende, opgivne maskevidder: 2,0 mm, 0,9 mm, 0,55 mm, 0,25 mm og 0,125 mm. Jord­

suspensionen blev hældt igennem dette sigtesystem. Tilbageholdte partikler af den ønskede størrelse blev vasket på sigten 5 minutter med bruser, og enkeltparti.kler overført til fast næ­

ringssubstrat, tilsat antibiotika (100 ppm penicillin og 150 ppm streptomycin jvf. Appendix 2). Petriskålene blev inkuberet i mørke i 2 dage ved 24°C og derpå i inkubationsrum i skiftevis UV- lys/mørke (12t/12t) ved 24°C i 8 dage.

2.6.2 Metodeforsøg

2.6.2.1 Svampeflora i parallelt udtagede jordprøver

40 parallelle jordprøver blev udtaget repræsentativt den 17/6 i vårbyg i 0-3 cm's dybde. Fra hver prøve blev udlagt 5 organiske og 5 mineralske partikler (0,55-0,9 mm) på V8-agar (Appendix 2).

- 22 -

2.6.2.2 Svampeflora i jordprøver, udtaget i forskellig dybde Fire jordprøver blev udtaget den 21/6 i vårbyg i 0-3 cm, 3-5 cm og 5-10 cm's dybde i samtlige parceller. Prøverne blev blandet til en sammensat prøve, hvorfra der blev udtaget 1 delprøve. Fra 26 af disse delprøver fra hver dybde blev udlagt 10 organiske partikler (0,55-0,9 mm) på V8-agar.

2.6.2.3 Svampeflora på organiske og mineralske partikler

Til undersøgelse af svampefloraen på organiske og mineralske par­

tikler blev kun anvendt jordprøver fra det ubehandlede forsøgsled i 0-3 cm (vårbyg). Den 17/6 blev fra 40 prøver udlagt hhv. 120 organiske og 120 mineralske partikler. Den 5/7 og 16/8 blev fra 3 delprøver udlagt hhv. 60 organiske og 90 mineralske partikler, alle på V8-agar. Samtlige partikler var i størrelsesordenen 0,55- 0,9 mm. Der lægges højest 2 organiske partikler/petriskål og højest 4 mineralske partikler/petriskål.

Ved overførsel af organiske partikler neddyppes sigten i en kry­

stallisationsskål med 400 ml sterilt fortyndingsmedium (Winograd­

sky 1:20). Organiske partikler svømmer pgra. deres lave vægtfylde ovenpå og kan derefter overføres med en pasteurpipette til agar.

På den måde kan man håndtere meget små partikler. Ved overførsel af mineralske partikler er denne metode uanvendelig. Her anvendes

****************************************************************

Figur 2.2.

Sæsonsvingninger i jordens v andindhold (%) i dybderne 0-1 cm og 1-2 cm. Prøverne er udtaget i vinterhvede i perioden 22/5 til 11/8 1986.

Figure 2.2.

Moisture content (%) in soil samples, taken in winter wheat in the period from May 22nd to August 11th 1986 in depths of 0-1 cm and 1-2 cm.

Date

\

N>

GJ i

- 24 -

en pincet, og det er derfor umuligt at arbejde m e d partikler, som er opfanget på sigter med meget små maskevidder (<0.55 mm).

2.6.2.4 Svampeflora på partikler af forskellig størrelse

40 jordprøver blev udtaget den 3/1 1986 under vedvarende græs i 0-10 cm's dybde og sammenblandet. Heraf blev udtaget 4 delprøver, som blev vasket gennem sigtesystemet. Fra hver delprøve blev udlagt 10 organiske partikler af størrelserne 0,9-2 mm, 0,55-0,9 mm, 0,25-0,55 mm og 0,125-0,25 mm på V8-agar.

2.6.3 EFFEKT AF BEHANDLING MED TILT 250EC PA ISOLERING AF JORD­

SVAMPE (MARKFORSØG I VÅRBYG)

I 1985 blev effekten af Tilt 250EC blev undersøgt den 21/6 og 5/7 i prøver fra 0-3 cm's dybde. Den 21/6 blev fra 3 delprøver udlagt ialt 60 eller 70 organiske partikler fra hvert led, den 5/7 blev, ligeledes fra 3 delprøver, udlagt 60 organiske partikler fra hvert led på V8-agar. Samtlige partikler var af størrelsen 0,55- 0,9 mm.

2.6.4 EFFEKT AF BEHANDLING MED TILT 250EC PA ISOLERING AF JOR D ­ SVAMPE (MARKFORSØG I VINTERHVEDE)

Fra hver af 5 delprøver (een fra hver parcel) b.?.ev 10 organiske partikler af størrelsen 0,25-0,55 mm udlagt på jordekstraktagar (JEA) (Appendix 2). Udlægning af partikler blev foretaget 10 gange i løbet af forår og som m e r 1986 (22/5, 28/5, 2/6, 11/6, 25/6, 2/7, 9/7, 16/7, 29/7, 11/8) fra hver af de øverste 2 cm.

2.7 ISOLERING AF JORDSVAMPE (pladespredning)

2.7.1 EFFEKT AF BEHANDLING MED TILT 250EC PA ISOLERING AF J O R D ­ SVAMPE (MARKFORSØG I VINTERHVEDE)

Fra hver af 5 prøver (een fra hver parcel) blev afvejet delprøver

- 2 5 -

å 6 g jord m e d 3 decimalers nøjagtighed. Prøverne blev blendet med 500 ml fortyndingsmedium (Winogradsky 1:20) ved laveste has­

tighed i 2 minutter (Appendix 2). 1 ml af den omrystede j ord­

suspension blev overført til 9 ml sterilt fortyndingsmedium (for­

tynding 10“ 3) og 1 ml heraf overført til 9 ml sterilt fortyn­

dingsmedium (fortynding 10- ^). Fra hver fortynding blev på V8- agar udpladet 0,1 ml på 3 petriskåle, ialt 30 skåle/forsøgsled for hver dybde. Petriskålene blev inkuberet ved 24°C i mørke, og optælling af totalt antal gær- og skimmelsvampe foretaget efter 3 dage. Cladosp o r ium spp. og Penici l l i u m spp. blev optalt efter yderligere 7 dages inkubation.

2.8 IDENTIFIKATION AF JORDSVAMPE

2.8.1 Jordvask

Svampe, isoleret ved jordvask, er undersøgt ved hjælp af t ape­

præparater (Flegel, 1980) og bestemt i henhold til Barron (1968) og Domsch al. (1980). For isolater af Fusarium er der i en vis udstrækning foretaget artsbestemmelse ved rendyrkning på PSA og SNA agar (Appendix 2) og beste m m e l s e i henhold til Booth (1977) og Burgess & Liddell (1983). Artsb e s t e m m e l s e r n e af Fusarium er udført i samarbejde med lic. tech. U. Thrane, DTH.

Følgende kommentarer skal knyttes til jordvaskundersøgelserne:

- Begrebet "kolonisationskvotient" defineres som antal fremvok- sede svampe/antal undersøgte jordpartikler (Garns & Domsch, 1967).

- Det forekommer ikke sjældent, at langsomtvoksende svampe over- vokses af hurtigere voksende. I tilfælde hvor dette har umulig­

gjort identifikation, er anvendt benævnelsen "overvoksede iso­

later” .

- "Sterile isolater" omfatter isolater med septerede hyfer, som ikke er sporuleret under de givne inkubationsbetingelser.

- Til Phycomycetes er henregnet sterile isolater med usepterede hyfer.

- 26 -

- Til formorden Sphaeropsidales er henregnet isolater, hvis koni­

dier dannes i pyknider. Langt de fleste isolater har 1-cellede ellipsoide, mørke konidier og tilhører sandsynligvis slægten PJaoma Sacc.

- Cephalosporium-lignende isolater er defineret i henhold til Garns (1971).

- Til p r i m æ r e s a p r o t r o f e s v a m p e er m e d r e g n e t f ø l g e n d e : Alt£xiiaz.ia> Böixyiis £in£££a, Clado s p o r i um spp., Epjcoccum purpurascens (= EL nigrum Link ex Link), Stemphylium botryosum - Kun få isolater er bestemt til artsniveau. Autornavne på slæg­

ter og arter findes i Appendix 3, men er for overskuelighedens skyld ikke medtaget i resten af teksten.

- Inden for slægterne Fusarium og Penic i l l i u m er der foretaget flere artsbestemmelser end det fremgår af efterfølgende. Disse resultater vil blive publiceret andetsteds, når de er f æ r ­ digt bearbejdede.

2.8.2 Pladespredning

I forbindelse med pladespredningsforsøgene er opgjort antal skim­

melsvampe og antal gærsvampe. Blandt skimmelsvampene er foretaget optælling af Cladosporium spp. og Pe n i c U li um spp. Enkelte repræ­

sentative gærsvampe er identificeret af professor A. Stenderup, Afd. for Medicinsk Mykologi, Århus Universitet.

2.9 EFFEKT AF BEHANDLING MED TILT 250EC PA DEN MIKROBIELLE RESPIRATION I JORDPRØVER, UDTAGET FRA MARKFORSØG I VINTERHVEDE

I jordprøver, udtaget den 22/5, 3/6, 9/7 og 11/8 1986 blev der foretaget bestemmelse af respiration (CO2-udvikling) i laborato­

rieforsøg efter en metode, modificeret efter Petersen (1926).

Forsøgene blev udført med jord, tilsat 0,5% lucernemel. På grundlag af vandbestemmelsen blev udregnet hvor meget jord (våd­

vægt), der skulle tages i anvendelse for at svare til 50 g tør jord. Jord og lucernemel blev blandet grundigt, og en m æ n g d e

- 27 -

svarende til 50,3 g tør jord + lucernemel blev afvejet i 1 liter flasker. Hver flaske blev vandet op til en vandprocent (våd­

vægtsbasis) på 17, svarende til m e l l e m 80 og 90% af jordens markkapacitet. Flaskerne blev inkuberet ved 25°C. C02-udviklingen blev målt efter 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 18, 23 og 29 dage på gaschromatograf (GC) med varmetrådsdetektor og Porapak R kolonne (Bridge current: 150 mA; Detektortemperatur: 250 grader; He-Flow:

2 ml/min; Injektion: 1.0 ml). På grundlag af en standardkurve (1, 2 og 3 % C02 V/V) blev den udviklede C O2 / 5 0 9 tør j ° rd bestemt efter først at være korrigeret for blindværdi ved måling af C O2 i tom flaske. Flaskerne blev efter måling beluftet, og når CO2- indholdet i flaskerne var som i atmosfæren, blev jorden vandet op til begyndelsesvægten, og flaskerne inkuberet til næste måling.

2.10 STATISTISK RESULTATBEHANDLING

Resultater af mikrobiologiske populationsundersøgelser, som pla­

despredning og jordvask, er ikke normalfordelte (Parkinson al.. 1971; Atlas & Bartha, 1981). I sådanne tilfælde kan man anvende fordelingsfri statistik. Til jordvaskforsøgene er således brugt x2-test (chi square) ( 2 x 2 contingency tables med Yates' korrektion) (Campbell, 1974). Gennemsnitsresultaterne af plade- spredningforsøgene er testet med en t-test (forudsætter normal­

fordelt talmateriale), efter at det først blev eftervist, at variationen m e l l e m antallene af svampe/g tør jord fra de 5 fællesparceller ikke var statistisk signifikant, så hele materia­

let (n=15) kunne samles. Til at teste dette kan der foretages en variansanalyse på logaritmen til tallenes standardafvigelse. Når antallet af observationer i det enkelte forsøgsled er så højt som 15, er det rimeligt at antage, at gennemsnitsværdierne er normal­

fordelte (Kendall & Stuart, 1977 p.206).

- 2 8 -

3. RESULTATER

3.1 MARKFORSØG I VÅRBYG

Byggen var kun meget svagt angrebet af patogene bladsvampe. Det gennemsnitlige kerneudbytte ses i Tabel 3.1. Ved behandling viser resultaterne en udbyttestigning, som dog ikke er statistisk sig­

nifikant. LSD værdien er forholdsvis stor, hvilket skyldes en signifikant blokeffekt, som ikke kunne fork.’ares. Ved den høje dosering (5,0 l/ha) sås nogen svidningsskade og et fald i udbyt-

*****************************************************************

Tabel 3.1.

Kerneudbytte ved sprøjtning med Tilt 250EC i vårbyg 1985 og vinterhvede 1986 (hkg/ha).. LSD: mindste, signifikante forskel

(p<0,05) (ANOVA).

Table 3.1.

The yield in spring barley 1985 and winter wheat 1986 (hkg/ha) by application of Tilt 250EC. LSD: Least significant difference

(pC0,05) (ANOVA).

Dosering Vårbyg Vinterhvede

Ubehandlet 67 ,2a OO er

0 , 2 l/ha 69, 8a

0,5 l/ha 83 ,5a

1 , 0 l/ha 72,3a

5,0 l/ha 71,la 84,6a

LSD 5,5 3,9

*****************************************************************

tet i forhold til det led, som blev behandlet med 1,0 1 Tilt 250EC/ha. I Figur 3.1 ses forekomsten af Cladosporium spp. på de 3 øverste blade. På blad 2 og 3, som var fuldt udviklede ved sprøjtning, ses en meget kraftig effekt i form af et m i n d r e a n t a l / c m2 efter behandling. Der ses ingen tydelig effekt på

C ladosporium på fanebladet, som kun akkurat var synligt og sammenrullet på sprøjtetidspunktet. Resultater af øvrige under­

søgelser vedrørende forekomst af bladsvampe er omtalt i Elmholt (1986b). Følgende konklusioner medtages her:

- C ladospor ium spp. var meget hyppigere fore ko m m e n d e i led 1 (ubehandlet) og 2 (0,2 l/ha) end i led 3 (1,0 l/ha) og 4 (5,0 l/ha), også på de nedre, nekrotiske blade.

- Ved behandling sås en stigende forekomst af Mucoi både på grønne og - især - på nekrotiske blade.

- I led 3 og 4 sås en forøget forekomst af Sporobolomyces. Epi- coccum purpurascens og Aureobasidium på de grønne blade samt af Epicoccum purpurascens på de nekrotiske blade.

- Fusarium spp. blev fundet hyppigst på nekrotiske blade i led 2 og 3.

- Alternaria blev isoleret hyppigt, især fra nekrotiske blade, undtagen i led 4.

3.2 MARKFORSØG I VINTERHVEDE

Hveden blev i nogen grad angrebet af meldug og bladlus i løbet af sommeren. Da det faldt uden for forsøgets formål, er der ikke foretaget vurdering af angreb. Det gennemsnitlige kerneudbytte ses i Tabel 3.1. Resultaterne viser en statistisk signifikant forskel mellem det ubehandlede og de behandlede forsøgsled, men ikke mellem de behandlede indbyrdes. I Figur 3.2 ses forekomst af Cladosporium spp. på hvedens 3 øverste blade. I modsætning til byggen blev hveden sprøjtet 2 gange, sidste gang ved begyndende skridning, hvor fanebladets overside var fuldt eksponeret. Effek­

ten på forekomst af C ladospor ium spp. på fanebladet i hvede er større end i vårbyg. På blad 2 og - især - på blad 3 er der en meget stor effekt; således blev der i de fleste tilfælde talt 3-5 gange så mange C l a dosporium spp./ c m2 i led 1 (ubehandlet) som i led 3 (5,0 1 Tilt 250EC/ha).

blev kun fundet i led 1

- 30 -

Tabel 3.2.

Afsætning af Tilt 250EC (ug a.i./cm2) på jord og over plantedække ved 1. sprøjtning 27/5 og 2. sprøjtning 17/6 1986 (gennemsnit med s.d., s.e.m. og c.v.). l = ubehandlet. 2 = 0,5 l/ha. 3 = 5,0 l/ha.

Table 3.2.

Deposition of Tilt 250EC (|ig a.i./cm2) above the crop (winter wheat) and on the soil at the first application on May 27th and the second application on June 6th 1986 (means with s.d.

and e . V . ) . l = control. 2 = 0.5 1/ha. 3 = 5.0 1/ha.

, s.e.m.,

Led Treatment

Gennemsnitlig afsætning n ng a.i./cm2

Deposition

s.d. s.e.m. C . V .

1. sprøjtning (27/5)

Over

plantedække above crop

1 36 0,00 0 , 0 0 0 , 0 0 -

2 36 0,47 0 , 1 2 0 , 0 2 0,26

3 36 5,49 0 , 8 8 0,15 0,16

På jord on soil

1 36 0,00 0 , 0 1 0 , 0 0 -

2 36 0,23 0,07 0 , 0 1 '0,30

3 36 2,06 0,67 0 , 1 1 0,33

2. sprøjtning (17/6)

Over

plantedække above crop

1 36 0,00 0 , 0 1 0 , 0 0 -

2 36 0,44 0,09 0 , 0 2 0 , 2 0

3 34 4,28 0,65 0 , 1 1 0,15

På jord on soil

1 34 0,00 0 , 0 0 0 , 0 0 -

2 36 0,07 0,03 0 , 0 1 0,43

3 36 0,57 0,25 0,04 0,44

- 3 1 -

3.3 AFSÆTNING AF SPRØJTEVÆSKE

I afsætningsforsøget i vårbyg blev i gennemsnit på jorden afsat 22% af den mængde, som blev opsamlet over plantedækket. Resul­

taterne er mere udførligt beskrevet i Elmholt (1986b). I forsøget i vinterhvede blev målt afsætning i samtlige forsøgsled ved begge sprøjtninger hhv. over plantedækket og på jorden (Tabel 3.2). Ved begge disse sprøjtninger lå vindhastigheden m e l l e m 3,4 og 5,4 m/sek. Udsprøjtning af 0,25 1 Tilt 250EC/ha giver en teoretisk afsætning af 0,62 ug a.i./cm2 over plantedækket i led 2. Ved 1.

sprøjtning blev der i gennemsnit i led 2 fundet 0,47 ug a.i./cm2 over plantedækket og 0,23 (ig a.i./cm2 på jorden, hvilket vil sige, at 49% blev afsat på jorden. I led 3 blev der afsat 5,49 ug a.i./cm2 over plantedækket mod 2,06 jig a.i./cm2 på jorden (afsæt­

ning på jord 38%). Ved 2. sprøjtning blev der i led 2 fundet 0,44 ug a.i./cm2 over plantedækket og 0,07 ug a.i./cm2 på jorden (afsætning 16% på jord), mens der i led 3 blev fundet 4,28 jig a.i./cm2 over plantedækket mod 0,57 ug a.i./cm2 på jorden (afsæt­

ning 13% på jord). Over plantedækket blev således genfundet mellem 70 og 90% af den teoretisk udregnede, udsprøjtede mængde propiconazol. Den laveste genfindelse blev fundet i led 3 ved 2.

sprøjtning.

3.4 ISOLERING AF JORDSVAMPE

3.4.1 Metodeforsøg (jordvask)

Resultater af metodeforsøg er samlet i Appendix 4.

3.4.1.1 Svampeflora i parallelt udtagede jordprøver

Ialt blev undersøgt 400 partikler fra 40 prøver (Appendix 4a).

Den gennemsnitlige kolonisationskvotient var 0,79+0,3 (varia­

tionsbredde 0,0-1,4). Isolater tilhørende slægten Fusarium blev fundet i 80% af prøverne, £*. culmorum i 43%. Isolater af slægten Penicillium blev fundet i 50% af prøverne, A c r e m a n l m n i 3 0%,

- 3 2 -

Figur 3.1.

Forekomst af Cladosporium spp./cm2 på byggens 3 øverste blade (gennemsnit med s.e.m., n=30). Prøver udtaget 22/7 1985.

Figure 3.1.

Occurrence of Cladosporium spp./cm2 on the upper 3 leaves of barley (means with s.e.m., n=30). Samples were taken on July 22nd 1985.

- 33 -

C y liüdxocajpon i 2 5%, Micx,Qdac,hium i 33%, M o r t ierella i 4 3%.

Sterile isolater (incl. Phycomycetes) blev fundet i 78% af p r ø ­ verne.

3.4.1.2 Svampeflora i jordprøver, udtaget i forskellig dybde Fra hver af de 3 dybder blev undersøgt 260 organiske partikler (Appendix 4b). Kolonisationskvotienten var ca. 1 for de øverste 3 cm, mens den var en smule lavere for de underliggende dybder. Det større antal svampe i det øverste jordlag skyldes en større forekomst af phycomyceter (Absidia. Mucor. Mortierella samt ste­

rile Phycomycetes), som udgjorde 30% i 0-3 cm's dybde og 24% i 3- 10 cm. Isolater af Fusarium udgjorde 9% i 0-3 cm og <5% i de 2 andre dybder. Peni c i l l i u m udgjorde 10-12% af isolaterne i alle dybder. Sterile, septerede isolater udgjorde 18% i prøverne ind­

til 5 cm's dybde og 22% i 5-10 cm's dybde. De øvrige svampe (herunder primære saprotrofe svampe) blev fundet med meget lave frekvenser.

3.4.1.3 Svampeflora på organiske og mineralske partikler

Til belysning af svampevækst fra forskellige slags partikler blev undersøgt 240 organiske og 300 mineralske partikler (Appendix 4c). Der er meget stor forskel på kolonisationskvotienten, som for organiske var 1,31 og for mineralske 0,70. Desuden er der store forskelle i svampefloraens sammensætning. Således udgjorde Fusarium 31% af isolaterne fra organiske partikler mod 4% for

*****************************************************************

Figur 3.2.

Forekomst af Clad os p o r i u m spp./ c m2 på hvedens 3 øverste blade efter behandling med Tilt 250EC (gennemsnit med s.e.m., n=10).

Prøver udtaget i perioden 27/6 til 11/8 1986.

Figure 3.2.

Occurrence of Clad o s p o r i u m spp./ c m2 on the upper 3 leaves of wheat (means with s.e.m., n=10). Samples were taken during the period of June 24th to August 11th 1986.

- 34 -

30 -

20

10

Cladosporium spp./cm

LU

UM) ■- , J ” T <- , / » * / " O

a. FANEBLAD FLAG LEAF

30

20

10

Cladosporium spp./cm2 O Ubehandlet

^ 0,25+0,25

■ 2,50+2,50 b. BLAD 2

LEAF 2

rti

I

f j

2 't/6 ^{7/7 16/7}

I

f-

31/7

*

11/8

- 3 5 -

<tO

30

20

10

Cladosporium spp./cm2 I I Ubehandl.

Ü 0,25+0,25

■ 2,50+2,50 c. BLAD 3

LEAF

3

2 V 6 7/7 16/7

mineralske. Gærsvampe blev ikke fundet på de organiske partikler, mens de udgjorde 8% af isolaterne fra mineralske partikler.

Phycomycetes udgjorde 20% af isolaterne fra organiske partikler mod 3% fra mineralske. Primære saprotrofe svampe udgjorde 10% af isolaterne frä organiske partikler mod 3% fra mineralske partik­

ler. Fra mineralske partikler blev isoleret en række langsomtvok- sende svampe, fx. Exophiala jeanselmei, F u sarium m er ism o i d e s , Ramichlorid i u m ssimlz,exi, Tetracladium setjgerum, Verticillium tenerum og Volutella ciliata.

3*

- 36 -

3.4.1.4 Svampeflora på partikler af forskellig størrelse

Til undersøgelse af den isolerede svampefloras sammensætning som funktion af partikelstørrelse blev undersøgt 40 organiske partik­

ler af 4 størrelsesordener (Appendix 4d). Der ses en tydelig stigning i kolonisationskvotient med 0,95 for partikler på 0,125- 0,25 mm, 1,08 for partikler på 0,25-0,55 mm, 1,48 for partikler på 0,55-0,9 m m og 1,68 på partikler på 0,9-2 mm. Ligeledes steg andelen af overvoksede isolater fra <5% for de 2 mindste maske­

vidder til 25-30% for de største. L an g s o mtvoksende svampe som Ramichloridium schulzeri. Beauveria bassiana. gærsvampe, og Phia- 1 ophora blev kun isoleret fra partikler <0,55 mm, mens phyco- myceter kun udgjorde 3% af svampene på disse partikler mod 70% på partikler >0,55 mm. Fusarium udgjorde 5% af isolater fra partik­

ler <0,55 mm, 20% af isolater på partikler af størrelse 0,55-0,9 m m og 25% af isolater på partikler af størrelse 0,9-2 mm. Sterile isolater udgjorde 36% af isolater på partikler <0,55 mm mod 21%

af isolater på partikler >0,55 mm. P e n i c i l l i u m udgjorde 3% af isolater på partikler <0,55 mm mod 10% af isolater på partikler

>0,55 mm.

3.5 EFFEKT AF BEHANDLING MED TILT 250EC I VÅRBYG PA JORDSVAMPE

Effekten af Tilt 250EC blev undersøgt 3 dage efter sprøjtning (21/6) og 17 dage efter sprøjtning (5/7). Den 21/6 lå k o l o n i s a ­ tionskvotienten mellem 0,93 i led 1 (ubehandlet) og 1,30 i led 2

(0,2 l/ha) (Appendix 4e). En x 2-test viser, at kun forskellen i antal partikler med svampevækst mellem led 1 og 2 er statistisk signifikant (p<0,05), jvf. Appendix 5. Hvad angår svampefloraens sammensætning er der ingen iøjnefaldende forskelle. Den 5/7 var kolonisationskvotienten generelt højere, varierende fra 1,38 i led 2 til 1,85 i led 3 (1,0 l/ha) (Appendix 4f). I ingen t i l ­ fælde var forskellene mellem leddene mht. antal partikler m e d vækst signifikant (Appendix 5). Antallet af phycomyceter synes korreleret til behandlingseffekt, således udgjorde de 25% af isolaterne i led 1, 28% i led 2, 38% i led 3 og 47% i led 4 (5,0

- 3 7 -

1/ha) .

3.6 E F F E K T A F B E H A N D L I N G M E D T I L T 2 5 0 E C I V I N T E R H V E D E PA JORDSVAMPE

3.6.1 Jordvask

Jordvask blev brugt til at isolere jordsvampe fra alle 3 for­

søgsled i 0-1 cm og 1-2 cm's dybde i perioden 22/5 (inden sprøjtning) til 11/8 1986. Resultaterne ses i Tabel 3.3 og 3.4.

Gærsvampe f o rekom hyppigst i juni og første halvdel af juli.

Gærsvampe udgjorde 14% af isolaterne i 0-1 cm mod 10% i 1-2 cm. I det ubehandlede forsøgsled kan effekt af udtagningstidspunkt og dybde vurderes. Der ses ingen tydelig s a mmenhæng mellem udt a g­

ningstidspunkt og kolonisationskvotient, hverken i øverste eller næstøverste cm. Der var vækst fra 87% af partiklerne i 0-1 cm, fra 81% i 1-2 cm. Denne forskel er signifikant ((p<0,01) ved n u ­ test. De p r i m æ r e saprotrofe svampe udgjorde 5% af isolaterne i øverste cm mod 3% i næstøverste, og de forekom fortrinsvis i

*******************************£*********************************

Tabel 3.3.

Effekt af sprøjtning med Tilt 250EC i vinterhvede på forekomst af svampe, isoleret ved jordvask. Prøverne er udtaget i perioden 22/5 til 11/8 1986 i 0-1 cm og 1-2 cm. a, Antal undersøgte j o r d ­ partikler. b Antal partikler m/ vækst af svampe, c Partikler m/

vækst af svampe (%). d Antal isolerede svampe, e K o lonisations­

kvotient.

Table 3.3.

Effect of application of Tilt 250EC in winter wheat on the occurrence of fungi, isolated by soil washing. The soil samples were taken during a period from May 22nd to August 11th 1986 in depths of 0-1 cm and 1-2 cm. a Number of examined soil particles.

h Number of particles with fungal growth. £ Particles with fungal growth (%). d Numbers of isolated fungi, s. Quotient of coloniza­

tion.