på det molekylær-genetiske område

(1)

Rigshospitalet

Indsæt hjælpelinjer til placering af objekter

1. Højreklik uden for slidet og vælg Gitter og hjælpelinjer 2. Sæt kryds ved Vis

tegnehjælpelinjer på skærmen 3. Vælg OK

Indsætte Titel/beskrivelse og Navn 1. Vælg Indsæt i topmenuen 2. Vælg Sidehoved og Sidefod 3. Indtast dit navn, hvor der står Navn 4. Indsæt Titel/beskrivelse hvor der står Titel/beskrivelse 5. Vælg Anvend på alle eller Anvend hvis det kun skal være på et enkel slide

Den teknologiske udvikling på det molekylær-genetiske område

Karen Grønskov

Klinisk Genetisk Klinik, Kennedy Centret, Rigshospitalet

Klinisk Genetisk Klinik, Kennedy centret

Karen Grønskov

Titel/beskrivelse (Sidehoved/fod) 1

(2)

Opstil teksten i punkter Niveauer 1. Niveau = Bullets 22 pkt 2. Niveau = Bullets 22 pkt 3. Niveau = Bullets 20 pkt 4. Niveau = Bullets 18 pkt 5. – 9. Niveau = Bullets 16 - 10 pkt

For at få punktopstillet teksten (flere niveauer findes) brug Forøg listeniveau

For at få venstrestillet teksten uden punktopstilling, brug

Formindsk listeniveau

Rigshospitalet

Oversigt

Karen Grønskov)

• Gener

• Mutationer

• Sanger sekventering

• Next generation sequencing

• Panel, eksempel retinale dystrofier

• Exom sekventering, eksempel mikroftalmi

• Hel genomsekventering

(3)

Kromosomer

(4)

DNA, kromosomer, gener

http://www.bbc.co.uk/schools/gcsebitesize/science/add_aqa_pre

_2011/celldivision/celldivision1.shtml

(5)

Gener, DNA

http://1.bp.blogspot.com/-AeUccsMwjOA/VhqjR3lM0lI/AAAAAAAAEIk/9JpxKKKhSz0/s1600/Struktur%2BDNA%2B1.jpg

(6)

Gen struktur (eukaryoter)

15-03-2017 6

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Gene_structure_eukaryote_2_annotated.svg

(7)

http://www.ajconsultingcompany.com/transcription-to-translation.html

(8)

Mutationer, sekvensændringer

• Fra ændring af en enkelt base

• Til hele kromosomer

15-03-2017 8

(9)

Typer af mutationer, kromosomale

15-03-2017

http://www.vce.bioninja.com.au/_Media/block_mutations_med.jpeg 9

(10)

Trisomi 21

15-03-2017 10

http://qsota.com/down-syndrome/

(11)

Typer af mutationer, gener

• Substitutioner

• Insertioner

• Deletioner

15-03-2017 11

http://www.slideshare.net/legoscience/mutations-42479956

(12)

Punktmutation i PAX6

• GTGCGACATTTCCCG

• GTGCGACAGTTCCCGc

15-03-2017 12

• GTGCGACATTTCCCG

• GTGCGACAGTTCCCGc

Ile

Ser

Aniridi: manglende iris, generel underudvikling af øjet

(13)

Rigshospitalet

Man skal vide hvad man ser efter

Karen Grønskov

• Førhen mange forskellige analyse metoder

• Karyotypering (>3000 kb)

• Kromosom-array (større deletioner & duplikationer, >100 kb, hele genomet)

• MLPA (mindre deletioner & duplikationer, 0,1 – 1 kb, udvalgte regioner)

• Sanger sekventering (små ændringer, 1-100 bp), GÆT på et gen

• Next generation sequencing (NGS)

• Helgenom sekventering vil kunne erstatte alle disse

metoder

(14)

Sanger sekventering, gold standard

• Frederick Sanger 1970’erne

• Enkelt molekyle, max 1000 bp

• Genetisk diagnostik 1 gen ad gangen

• Kandidat gener, pin-point regioner

• Humane genom projekt

15-03-2017 14

(15)

Human Genom Projekt

• USA (NIH)

• 1985

• 1990

• 2003

• 20 institutioner,

• 3 milliarder USD

• 3 milliarder baser

• 20-30.000 gener

(16)

Rigshospitalet

Next generation sequencing – NGS Massively parallel sequencing

Navn (Sidehoved/fod)

• Den første NGS maskine midt 2000

• Mange sekvenser læses samtidig (40 mio)

• 2010 targeteret enrichment

• Paneler (5-200 gener)

• Whole exome sekventering (alt protein kodende, exons)

• ”Sygdomsgener” i OMIM +2000 fra 2008 (4787 i alt)

• Referencesekvens til sammenligning

(17)

Rigshospitalet

Reference sekvens

(18)

Rigshospitalet

Udvikling NGS 2001-2010

Karen Grønskov

Elaine Mardis, Nature 2011, 470:198–203

(19)

Pris

100.000.000 $

1000 $

15 år

(20)

Sanger sekventering

ABCA4A

(21)

Panel

ABCA4A

RP1

PAX6

PRPH2 USH2A

BEST1

(22)

Retinale dystrofier

• Øjensygdom, nedbrydning af øjets nethinde

• Genetisk heterogeneitet

• Ca. 200 gener

https://thumbs.dreamstime.com/z/photoreceptor-cells-retina-eye-27214192.jpg

(23)

Retinale dystrofier

• 500 (800) prøver fra personer med retinal dystrofi

• NGS panel

• 124 gener,

• kodende regioner plus 200 bp intron

• 2 mio baser

(24)

Varianter NGS panel

4000

500 20 3500 ligger udenfor

kodende region

480 er fælles med mange

mennesker

(25)

P e rson e r

0 50 100 150 200

250

45 %

35 %

20 %

Færdige Ekstra under- søgelser

Ingen

fund

(26)

0 10 20 30 40 50 60

ABC A 4 EYS RHO R P1 C R B1 PD E6 A C AC N A1 F PD E6 B C EP2 9 0 C 2 O R F 7 1 BBS 1 IM PD H 1 N R 2 E3 R P9 BB S 2 RDH12 R P1 L 1 AI PL 1 BBS 1 2 BBS 9 CDH3 C ER KL MKK S PI T PN M 3 R L BP 1 T R P M1 AL MS 1 BBS 7 C N G A 1 D F N B 3 1 G N A T 1 G PR 9 8 G U C A 1 A IG C B1 IN P P5 E L R AT MKS 1 PR PF 3 PR PF 8 R PE 6 5 SD C C AG 8 T T C 8

Hyppige gener

 ABCA4

 EYS

 USH2A

 BEST1

 RHO

 PRPH2

 RP1

(27)

Mange forskellige gener

0 10 20 30 40 50 60

ABC A 4 EYS RHO R P1 C R B1 PD E6 A C AC N A1 F PD E6 B C EP2 9 0 C 2 O R F 7 1 BBS 1 IM PD H 1 N R 2 E3 R P9 BBS 2 RDH12 R P1 L 1 AI PL 1 BBS 1 2 BBS 9 CDH3 C ER KL MKK S PI T PN M 3 R L BP1 T R P M1 AL MS 1 BBS 7 C N G A 1 D F N B 3 1 G N A T 1 G PR 9 8 G U C A 1 A IG C B1 IN P P5 E L R AT MKS 1 PR PF 3 PR PF 8 R PE6 5 SD C C AG 8 T T C 8

500 prøver: sekvensvarianter i 83

forskellige gener

(28)

Exom sekventering, metode

https://www.my46.org/sites/www.my46.org/files/pictures/11My46_Gen101_Exome_final.png

(29)

Rigshospitalet

NGS, Exom sekventering 1

Karen Grønskov

Biesecker NEJM 2014 370:2418

(30)

Rigshospitalet

NGS, Exom sekventering 2

Karen Grønskov

Biesecker NEJM 2014 370:2418

(31)

Mikrofthalmi / anofthalmi

• Årsager:

• Genetiske

• Miljømæssige årsager

• Arvegang:

• Autosomal recessiv

• Autosomal dominant

• X-linked

• >50 gener kendes

• Hvert gen bidrager kun lidt

Læge Laura Roos, phd projekt

Roos L, et al. Clin Genet. 2014 Sep;86(3):276-81

(32)

I II III

IV

1 2

1 2 3 4

1 2 3

1 2 3 4 5

Familie med mikroftalmi

Roos L, et al. Clin Genet. 2014 Sep;86(3):276-81

(33)

Exom sekvenetering

I II III

IV

1 2

1 2 3 4

1 2 3

1 2 3 4 5

Roos L, et al. Clin Genet. 2014 Sep;86(3):276-81

(34)

Analyse

• Indgift familie:

• Homozygot hos de syge, heterozygot eller vild type hos den raske

• Sjælden sygdom, dvs ikke en ændring man ser hos andre

I II III

IV

1 2

1 2 3 4

1 2 3

1 2 3 4 5

Roos L, et al. Clin Genet. 2014 Sep;86(3):276-81

(35)

Exom sekventering

20.000

4.000 Homozygote hos de 2 syge Heterozygote/vild type hos rask

2 Kun kodende varianter 37

Alle hyppige SNPs fjernes Databaser: dbSNP135, ExAC

1. ALDH1A3

Publikation 2013 mikrofthalmi 2. FLJ42289

Lav dybde

Funktion ukendt

(36)

I II III

IV

1 2

1 2 3 4

1 2 3

1 2 3 4 5

N

He

Ho Ho Ho

Ho: c.[521G>A];[521G>A]

He: c.[521G>A];[=]

N: c.[=];[=]

ALDH1A3

Roos L, et al. Clin Genet. 2014 Sep;86(3):276-81

(37)

http://www2.le.ac.uk/departments/genetics/vgec/schoolscolleges/topics/genomics

Helgenom sekventering

Whole genome sequencing (WGS)

(38)

Rigshospitalet

NGS, Helgenom sekventering 1

Karen Grønskov

Biesecker NEJM 2014 370:2418

(39)

Rigshospitalet

NGS, Helgenom sekvenetering 2

Karen Grønskov

Biesecker NEJM 2014 370:2418

(40)

Rigshospitalet

NGS METODE

• Bibliotek (laboratorie arb)

• Sekvens (fastq fil)

• Quality filtering

• Alignment til reference genom (BAM fil)

• Finde (calling) forskelle mellem reference og sekvens (VCF fil)

• Variant filtrering

• Analyse af data, fortolkning

(41)

Rigshospitalet

NGS – udbudt i diagnostik

• Paneler (fra ca 5 til 200 gener)

• Exom sekventering (alle kodende exons, ca 1% af genomet)

• Evt. paneler baseret på exom sekv.

• Helgenom sekventering (ALT, alle 3 mia baser)

(42)

Rigshospitalet

Tendens

Karen Grønskov