• Ingen resultater fundet

2 Tak til… ......................................................................................................................................................... 4 Forord .................................................................................

N/A
N/A
Info
Hent
Protected

Academic year: 2022

Del "2 Tak til… ......................................................................................................................................................... 4 Forord ................................................................................."

Copied!
52
0
0

Indlæser.... (se fuldtekst nu)

Hele teksten

(1)
(2)

Tak  til…  ...  4  

Forord  ...  5  

Introduktion  ...  6  

Tungmetaller  i  det  arktiske  Grønland  ...  7  

Den  arktiske  tidevandszone  ...  9  

Blåmuslingen  Mytilus  edulis  ...  12  

Blåmuslingens  økologi  og  biogeografi  ...  12  

Blåmuslingen  som  miljøindikator  ...  13  

Blåmuslingens  kuldetolerance  ...  14  

Blykontaminerede  blåmuslinger  i  Arktis  ...  15  

Cellemembraner  hos  ektotermer  stresses  af  kulde  og  bly  ...  16  

Cellemembranen  ...  16  

Cellemembranens  temperatursensitivitet  ...  18  

Kulde  stresser  membranen  hos  ektoterme  organismer  ...  18  

Peroxidering  af  cellemembranen  ...  19  

Bly  øger  peroxidering  og  stresser  membranen  ...  20  

Synergetisk  stressinteraktion  mellem  kulde  og  tungmetal  ...  21  

Aktuelt  studie  ...  23  

Manuscript  ...  27  

Abstract  ...  29  

1.  Introduction  ...  30  

2.  Materials  and  Methods  ...  33  

2.1  Animals  and  holding  conditions  ...  33  

2.2  Experimental  design  ...  33  

2.3  Pb  analysis  ...  34  

2.4  PLFA  analysis  ...  34  

2.5  Statistical  analysis  ...  35  

3.  Results  ...  35  

3.1  Pb  content  in  mussels  ...  35  

3.2  Effects  of  Pb  on  PLFAs  ...  36  

3.3  Effects  of  sub-­‐zero  temperatures  and  Pb  on  survival  ...  37  

4.  Discussion  ...  39  

4.1  Internal  lead  ...  39  

(3)

4.2  Pb  effect  on  PLFA  composition  and  survival  ...  40  

4.3  Implications  for  risk-­‐assessments  ...  41  

Acknowledgements  ...  42  

References  ...  43  

(4)

Tak til…

Jeg vil gerne takke min vejleder, Mikael Kristian Sejr, Seniorforsker ved Arktisk Forskningscenter, Institut for Bioscience, Aarhus Universitet, for god og brugbar vejledning og en stor villighed til at give mig de bedste rammer for mit speciale. Jeg vil også takke Jakob Thyrring, Ph.d. studerende ved Arktisk Forskningscenter, Institut for Bioscience, Aarhus Universitet, som har været medvejleder og en stabil, hjælpsom og inspirerende støtte og samarbejdspartner igennem hele projektet. Endvidere vil jeg takke Martin Holmstrup, Professor ved Jordfaunaøkologi og Økotoksikologi, Institut for Bioscience, Aarhus Universitet, for vejledning og hjælp til gennemførelse af og forståelse for laboratoriearbejdet. I denne forbindelse vil jeg også takke Lise Lauridsen, Stine Slotsbo og Ana Silva Patricio, som ligeledes har været meget behjælpelige og imødekommende i forbindelse med mit laboratoriearbejde. Jeg vil gerne takke Matilde Rasmussen og Siri Elmegaard for inspirerende feedback og mine kontormakkere Ane Middelbo og Sofie Mathiessen for mange gode timer på kontoret. Afslutningsvis takker jeg Bo Michelsen samt familie og venner for støtte og opmuntring igennem hele processen.

(5)

Forord

Hypotesen i dette specialestudie er, at der er synergi imellem effekterne af bly i økologisk realistiske koncentrationer og realistisk temperatur på blåmuslingens kuldetolerance i Arktis. Som mulig mekanistisk forklaring herpå undersøges det, hvorvidt den potentielle synergetiske interaktion på kuldetolerancen skyldes, at bly resulterer i membranskader via ændringer i cellemembranens fedtsyrekomposition. Specialet består af en introduktion til emnet, hvor den teoretiske baggrund for hypotesen gennemgås. Efterfølgende forefindes manuskript til en artikel omhandlende selve studiet med henblik på udgivelse i det videnskabelige tidsskrift Aquatic Toxicology.

Introduktionen giver først et overblik over den grønlandske minehistorie og hvordan tungmetalforurening, såsom bly, i visse marine områder udgør en risiko for den arktiske flora og fauna. Herefter følger en kort beskrivelse af den arktiske tidevandszone, hvor arktiske organismer udsættes for ekstrem kulde. Det tredje afsnit omhandler specialets forsøgsorganisme, blåmuslingen, som er en dominerende art i den arktiske tidevandszone og en hyppigt anvendt marin miljøindikator for tungmetaller. Fjerde afsnit er et teoretisk overblik over cellemembranens fysiske og fysiologiske egenskaber og vil belyse hvorledes denne stresses af både kulde og tungmetal. Dette afsnit danner således baggrund for vores hypotese om den mulige synergetiske stresseffekt af disse to faktorer på blåmuslingens kuldetolerance. Afslutningsvis opsummeres det teoretiske ræsonnement for det aktuelle studie, som manuskriptet omhandler.

(6)

Introduktion

Test  af  mulige  synergetiske  

interaktioner  mellem  frysegrader  og  bly  (Pb)   kontaminering  i  grønlandske  blåmuslinger    

(Mytilus  edulis)  

       

(7)

Tungmetaller  i  det  arktiske  Grønland  

Tidligere blev havet opfattet som et enormt reservoir for sikker bortskaffelse af forurenende stoffer såsom tungmetaller (Ansari et al. 2004, Torres et al. 2008). I dag er marin forurening med tungmetaller af antropogen oprindelse en global bekymring (AMAP 2005, Reichelt-Brushett 2012).

Dette skyldes tungmetallers bioakkumulering i, og mulige toksiske effekter på, marine organismer (Josefson et al. 2008, Torres et al. 2008, Søndergaard 2013). Den primære tungmetalforurening af Arktis sker via atmosfæren. Dette, samt minedriften i Arktis, har i de seneste årtier medført en tiltagende bekymring for forurening af det arktiske marine økosystem (AMAP 2010). I Arktis har cadmium (Cd) og kviksølv (Hg) størst økotoksikologisk betydning. Disse metaller findes i så høje koncentrationer i arktisk flora og fauna, at det har sundhedsmæssige konsekvenser for organismerne selv, men også for de mennesker der indtager dem (AMAP 2005). Endvidere er også bly fortsat en kilde til bekymring i Arktis på trods af, at det atmosfæriske indhold af bly er faldet signifikant efter forbuddet imod blyholdigt benzin i den vestlige verden (AMAP 2005). Særligt i visse marine områder nær minedrift findes der fortsat høje blykoncentrationer, hvilket uddybes nedenfor.

Minedrift har fundet sted i Grønland siden 1840’erne og landet er fortsat særdeles rigt på mange ressourcer såsom petroleum, gas, olie og forskellige mineraler, eksempelvis bly (Pb), zink (Zn), jern (Fe), kobber (Cu) og guld (Au) (Figur 1) (Rosing et al. 2014). Vedtagelsen af Grønlands Selvstyrelov i 2009 betød, at Grønland fik rettighederne over landets ressourcerigdom, inklusive underjordiske mineralressourcer. Dette har medført en politisk og økonomisk vilje til i langt højere grad at udnytte ressourcerne ved blandt andet minedrift, så landet kan opnå sin målsætning om at blive en selvstændig økonomi (Rosing et al. 2014). Eksempelvis har Grønland i de seneste år solgt et stigende antal minerettigheder til udenlandske minedriftskompagnier (Nuttall 2014) og minedrift forventes at bidrage betydeligt til den grønlandske økonomi allerede indenfor de næste 5-10 år (Rosing et al. 2014).

(8)

 

Figur   1   viser   de   størst   kendte   tungmetal-­‐   og   mineralreserver   i   Grønland.   Man   forventer   en   markant   øget   minedrift   på   mineraler   i   Grønland   de   kommende   år.   Efter   Rosing  et  al.  (2014).  

(9)

Udledning af mineaffald har betydet en markant tungmetalforurening af nogle grønlandske fjorde. Den forhenværende bly- og zinkmine Black Angel i Maarmorilik, Vestgrønland, lukkede årligt 500.000 tons mineaffald direkte ud i det omkringliggende fjordsystem indtil den lukkede i 1990 efter 17 års drift (Loring & Asmund 1989b). Da minedriften var på sit højeste, målte man blyindhold i blåmuslinger (Mytilus edulis) på op til 800 µg/g (baggrundsindholdet var 3 µg/g) og man observerede bly- og zinkkontaminerede organismer op til 50 km fra minen (Loring & Asmund 1989b). Regelmæssig monitering fra minens åbning og frem til 2009 har vist, at koncentrationen af opløst bly og zink i havvandet faldt kraftigt ved minens lukning (0,1% i 1995 i forhold til 1988 (Schiedek et al. 2009)). Dog er indholdet af bly og zink i fjordsystemets organismer og sediment stadig kraftigt forhøjet 20 år efter minens lukning og dette forhøjede indhold ses op til 12 km fra minen (Søndergaard et al. 2011). Man har således for nylig fundet blåmuslinger ved Maarmorilik med blyindhold på op imod 3000 µg/g (Bach, 2014, pers. komm.) og man forventer at se forhøjede niveauer af zink og bly i fjordsystemets planter og dyr de næste 50 år (Søndergaard et al. 2011).

Rettighederne til Black Angel minen blev solgt i 2008 og bly-, zink- og sølvudvinding forventes genoptaget inden for de næste par år (Råstofstyrelsen 2013).

Lignende eksempler på tungmetalforurening af grønlandske fjorde fra minedrift er fra en olivinmine i Fiskefjorden i Sydvestgrønland (Søndergaard 2013) samt tungmetaludledning fra en kryolitmine i Ivittuut i Sydgrønland. I sidstnævnte eksempel måltes i 2007, 20 år efter kryolitminens lukning, et blyindhold i blåmuslinger på op til 200-500 gange baggrundsniveau (0,7- 1,7 µg/g) (Johansen et al. 2008b). Tungmetalforurening har således langvarige konsekvenser for den arktiske flora og fauna i Grønland og dette kan forblive et økologisk problem mange år endnu - både på grund af bioakkumulering i arktiske organismer og på grund af den forventede øgede mineaktivitet i Grønland.

Den  arktiske  tidevandszone  

Arktis kan defineres som området nord for polarcirklen (66°32′ N), men i denne introduktion defineres Arktis ud fra en isoterm med en maksimal gennemsnitlig lufttemperatur på 10°C i årets varmeste måned, hvilket økologisk set svarer til de 4,8% af jordens overflade nord for trægrænsen (Figur 2) (AMAP 1998, CAFF 2013).

(10)

Arktis rummer nogle af de mest ekstreme habitater på jorden kendetegnet ved permanent eller midlertidigt isdække samt op til 6 måneders kontinuerligt vintermørke, hvor primærproduktionen stort set ophører (Sejr, pers. komm.). Temperaturen kan komme ned på -25°C i vintermånederne, og der er store temperatursvingninger både dagligt og over året (Blicher et al. 2013).

Der er endvidere store stedslige variationer i temperaturen imellem de enkelte mikrohabitater. Dette fremgår eksempelvis af figur 3, som viser, at   alger   har   en   markant   isolerende   effekt   relativt   til   eksponerede   klipper   i   både   den   øvre   og  

midterste   tidevandszone   (Sejr et al.,

upubliceret).

Figur   2  viser   forskellige   definitioner   på   Arktis.   Den   stiplede   blå   linie   angiver   polarcirklen,   imens   den   røde   linie  angiver  en  isoterm  med  en  maksimal  gennemsnitlig   lufttemperatur  på  10°C  i  årets  varmeste  måned.  Når  der   i  denne  introduktion  tales  om  Arktis  menes  der  området   nord  for  denne  isoterm.  

Figur  3  viser  temperaturen  i  tidevandszonen  over  året  2011-­‐2012  i  Nuuk,  Grønland.  

Temperaturen  vises  i  (A)  den  øvre  tidevandszone,  (B)  den  midterste  tidevandszone   og   (C)   den   nedre   tidevandszone.   Temperaturen   vises   både   på   eksponerede   klipper   (rød  graf)  og  under  alger  (sort  graf).  Efter  Sejr  et  al.  upubliceret.  

(11)

Tidevandszonen er den del af kysten, der skiftevis dækkes og blotlægges af havvand som følge af tidevandets cyklus (Figur 4). I økotoksikologisk sammenhæng er tidevandszonen interessant, da denne zone ofte er særligt udsat for antropogen forurening (eksempelvis olieudslip og minedrift).

Desuden giver zonen let adgang til indsamling af marine organismer til økotoksikologiske studier.

Blotlægningen af havbunden i tidevandszonen eksponerer (semi)-sessile organismer for luft. I Arktis betyder det, at zonens organismer skal kunne klare lufttemperaturer ned til -25°C (Blicher et al. 2013), hvorfor lufttemperatur er vigtigt for hyppigheden og distributionen af organismer i den arktiske tidevandszone. Endvidere er andre abiotiske stresspåvirkninger som eksempelvis bølger og is også af betydning herfor (Aarset 1982, Aunaas et al. 1988). Scrosati og Eckersley (2007) undersøgte kanten af landisens, den såkaldte ”isfods”, effekt i tidevandszonen i St. Lawrence Bugten i det østlige Canada, der har lufttemperaturer tilsvarende i Arktis. Studiet viste, at isfoden har en isolerende effekt, da lufttemperaturer ned til -20°C aldrig gav en lavere temperatur under isfoden end -7°C. Studiet indikerer, at isfoden yder langsigtet beskyttelse til zonens organismer imod meget lave frysegrader (Scrosati & Eckersley 2007).

Figur  4  viser  en  skematisk  oversigt   over  tidevandszonen  (”intertidal”)   og  de  zoner,  der  grænser  op  her  til.  

(12)

Blåmuslingen  Mytilus  edulis  

Organismer i tidevandszonen er som nævnt interessante i økotoksikologiske studier, da tidevandszonen ofte er særligt udsat for forurening. I sådanne studier anvendes blåmuslingen (Mytilus edulis) ofte, da den er en ideel miljøindikator (Figur 5), hvilket blandt andet vil blive uddybet i dette afsnit.

Blåmuslingen M. edulis er en del af et artskompleks med Mytilus trossulus og Mytilus galloprovincialis. Arterne er morfologisk set ens, men de adskiller sig

genetisk (Mcdonald & Koehn 1988, Westfall & Gardner 2010). I Grønland er der kun identificeret M. edulis (Wanamaker et al. 2007, Versteegh et al. 2012). Når ”blåmuslingen” i denne introduktion benævnes, refereres der til M. edulis, med mindre andet er angivet.

Blåmuslingens  økologi  og  biogeografi  

Blåmuslingen er en bentisk, semisessil filtrator (Bayne et al. 1976, Seed 1976, Gosling 2003).

Arten kan tilpasse sig relativt store fluktuationer i abiotiske forhold (som temperatur, salinitet, udtørring og ilt) og kan derfor leve i en bred vifte af habitater (Seed & Suchanek 1992).

Eksempelvis findes M. edulis fra tidevandszonen og ned til 40 m, i både brakvand og havvand samt under både milde og ekstreme temperaturforhold (Seed & Suchanek 1992)(FAO 2014a). Den er fremherskende på stejle, bølgeudsatte kyster og dominerer både i tidevandszonen og kystzonen (”subtidal” på figur 4). I den arktiske tidevandszone er lufttemperatur samt lokal fysisk stress fra skurrende isflager afgørende for blåmuslingens øvre udbredelsesgrænse (Gosling 2003, Blicher et al. 2013). Arten danner store banker ved hjælp af fasthæftning med byssustråde til substrat og til hinanden. Blåmuslingen er økologisk set en vigtig art, da den danner fødegrundlag for mange organismer såsom fugle, fisk og invertebrater. De tætte muslingebanker fungerer endvidere som habitat for et artsrigt alge- og dyresamfund (Seed 1976, Seed & Suchanek 1992). Blåmuslingen er desuden af stor kommerciel betydning (FAO 2014b).

Figur   5.  Blåmuslinger   vokser   i   tætte   banker   og  filtrerer   vandet  for  fødepartikler  med  gællerne.  

(13)

Temperatur er afgørende for blåmuslingens biogeografi og artens nordlige grænse afgøres af minimum lufttemperatur, hvilket eventuelt kan modificeres af en isfod (Seed 1976, Scrosati &

Eckersley 2007, Jones et al. 2010). Blåmuslingen er særligt udbredt på den nordlige halvkugle (Seed & Suchanek 1992) og den findes i arktiske områder i Norge, Rusland, Canada og Grønland i både tidevandszonen og kystzonen (Figur 4) (Blicher et al. 2013). I de seneste år er blåmuslingen endvidere blevet observeret på både Svalbard og i Qaanaaq i det nordvestlige Grønland. Hvorvidt muslingerne gyder i disse områder eller fragtes hertil i larvestadiet med havstrømme vides endnu ikke (AMAP 2012, Thyrring, pers. komm.).

Blåmuslingen  som  miljøindikator  

Organismers optag af tungmetaller er oftest proportionelt med mængden af metallet i omgivelserne (Livingstone & Pipe 1992). En miljøindikator for tungmetal kan defineres som en art, der akkumulerer tungmetaller i sit væv. Herved fås et mål for biotilgængelighed af tungmetal i det pågældende miljø, det vil sige hvor stor en andel af den totale tungmetalmængde, der er tilgængelig for dyr og planter og således økotoksikologisk relevant (Rainbow 1995). Dette mål afhænger af miljøindikatorens optagelses- og udskillelsesrate af et pågældende metal (Søndergaard et al. 2014).

Miljøindikatorer kan således anvendes til at analysere geografiske og temporale variationer i biotilgængeligheden af tungmetal i marine økosystemer (Rainbow 1995).

Udover at opfylde kravet om akkumulering af tungmetaller i vævet, så er ideelle miljøindikatorer sessile, hyppigt forekommende, nemme at identificere, robuste overfor skiftende abiotiske forhold og de har en relativt lang levetid (Søndergaard et al. 2014). Blåmuslingen lever oftest op til de fleste af disse kriterier. Som filtrator optager blåmuslingen både tungmetal opløst i vandet og bundet til partikulært materiale (Rainbow 1995), hvilket gør blåmuslingen særligt attraktiv til risikovurdering af tungmetaller i akvatiske miljøer, også af bly (Schulz-Baldes 1974, Phillips 1976, Simpson 1979, Bourgoin 1990, Widdows & Donkin 1992, Mubiana et al. 2005). Blåmuslingen er særdeles velegnet til risikovurdering af kystnære områder nær minedrift, da organismen er en dominerende art langs klippekyster (Rainbow 1995), og den har da også hyppigt været anvendt til dette formål i Grønland (Loring & Asmund 1989b, Riget et al. 1997, Johansen et al. 2008b, Søndergaard et al. 2011, Zimmer et al. 2011, Søndergaard 2013, Søndergaard et al. 2014).

(14)

Blåmuslingens  kuldetolerance  

Blåmuslingen er en af de mest kuldetolerante organismer i den arktiske tidevandszone (Aarset 1982). Kuldestress og -mortalitet er normalt i den arktiske region, og kuldetolerance er således af afgørende betydning for blåmuslingens fitness og distribution (Aarset 1982, Bourget 1983). Når blåmuslingen udsættes for kold luft i tidevandszonen lukkes skallen i, hjerteraten og cilieaktiviteten nedsættes og anaerob metabolisme indtræffer (Aarset 1982). Blåmuslingens kuldetolerance består i, at den tåler frysning af ekstracellulærvæsken, ligesom mange andre kuldetolerante organismer (Aarset 1982). Supercooling, en proces hvor en væske holdes flydende under dets frysepunkt, er ifølge ældre studier ikke observeret hos blåmuslingen (Williams 1970, Aarset 1982), men det er for nylig observeret, at blåmuslinger først fryser ved -5 til -8°C afhængig af størrelse (Sejr, upub. data).

Så længe cellerne ikke fryser intracellulært, kan de potentielt overleve perioder med lave frysegrader (Mazur 1977, Odintsova & Boroda 2012). Når ekstracellulærvæsken fryser, mindskes molfraktionen af frit vand, og intracellulært vand bevæger sig da ud i det ekstracellulære rum ved osmose, hvilket fører til cellulær dehydrering (Aarset 1982). Cellernes kuldetolerance afgøres af en maksimal tolerance overfor dehydrering og/eller et minimum tolereret cellevolumen. Williams (1970) har påvist, at blåmuslingen kan overleve frysning af op til 64% af dens kropsvæske.

Kuldeskade indtræffer således, når en vis mængde af kropsvæsken fryser (Williams 1970, Aarset 1982). En del af forklaringen herpå kan være, at intracellulære proteiner ofte er hydrerede, hvilket stabiliserer proteinstrukturen. Ved cellulær dehydrering kan det bundne vand ekstraheres ved osmose, hvormed proteinerne kan denaturere med kronisk celleskade som følge. Dehydrering af cellen kan desuden medføre membranskader (Karow & Webb 1965, Meryman 1971). Irreversible kuldeskader ved kuldestress kan resultere i en øget mortalitet hos blåmuslingen, der først indtræffer flere uger efter stresspåvirkningen (Aarset 1982).

En afgørende del af blåmuslingens kuldetolerance menes at bestå i, at arten kan regulere den intracellulære koncentration af frie aminosyrer. Ved at øge koncentrationen kan cellen sænke intracellulærvæskens frysepunkt samt opretholde et vist osmotisk potentiale, der muliggør regulering af cellevolumen. Cellen kan således undgå en letal grad af dehydrering ved kuldestress (Williams 1970). I overensstemmelse med denne teori er det observeret, at blåmuslinger akklimatiseret til høj salinitet har en højere kuldetolerance (Williams 1970). Det kan skyldes, at det hyperosmotiske saline miljø får cellerne til at dehydrere. Det resulterer i et cellulært respons, der øger mængden af frie aminosyrer. Herved er cellerne bedre rustet til at modstå efterfølgende

(15)

kuldestress. Desuden medfører den høje salinitet en mindre isdannelse ekstracellulært og deraf en lavere grad af cellulær dehydrering (Lange 1963, Williams 1970).

Udover fysiologisk baseret kuldetolerance kan blåmuslingen også beskyttes via artens tendens til at vokse i banker, under alger og i klippesprækker, hvilket kan beskytte dem imod kulde, is og bølger (Williams 1970). Det er endvidere muligt, at blåmuslingens kappehule fungerer som et internt varme-reservoir, når blåmuslingen ved lavvande fryser i den arktiske tidevandszone.

Kappehulen rummer cirka 10 gange så meget vand som vævet. Havvand i kappehulen fryser før vævet. Isdannelsen er en ektoterm proces, der frigiver latent varme til vævet således, at vævsfrysning forsinkes. Frysning af kappehulen kan dermed forkorte den periode, hvor vævet er frosset ved lavvande. Dette bidrager til blåmuslingens kuldetolerance, eftersom blåmuslingens mortalitet ved kulde i høj grad afgøres af, hvor længe vævet eksponeres for frysning (Williams 1970, Aarset 1982). Store individer er mere kuldetolerante end små individer (Bourget 1983), sandsynligvis fordi deres kappehule indeholder mere vand og fordi de har et mindre overflade/volumen forhold, hvilket også giver en langsommere afkøling.

Blåmuslingen adapteres til kulde ved naturlig selektion. Bourget (1983) fandt, at LT50

(temperatur, hvor 50% dør) for blåmuslinger i tidevandszonen i den canadiske St. Lawrence Bugt var -17,5°C for store muslinger (> 3cm) ved 24 timers stresseksponering. Ved sammenligning med et tidligere studie, der viste en lavere kuldetolerance hos blåmuslinger fra et mildere klima (-10°C i Massachusetts, New England, (Williams 1970)), konkluderede Bourget (1983), at der hos blåmuslingen selekteres for kuldetolerance i arktisk klima.

Det enkelte individ kan endvidere akklimatisere sig til kulde ved at øge sin kuldetolerance over tid. Gællevæv fra blåmuslingen øger kuldetolerancen efter 2-3 uger ved overførsel fra 15 til 5°C, hvorimod kuldetolerancen hos kulde-akklimatiserede dyr allerede mindskes igen efter 1 uge ved overførsel til højere temperatur (Theede 1972).

Blykontaminerede  blåmuslinger  i  Arktis  

Blåmuslingen bioakkumulerer tungmetaller opløst i havvandet samt via føden. Artens optag af tungmetal opløst i havvand er ikke en temperaturafhængig proces (Baines et al. 2006), hvorimod artens tungmetaloptag fra føden er langt mere effektiv ved lav temperatur (2°C) end ved høj temperatur (12°C) (Baines et al. 2005). Forskellen i assimileringseffektiviteten var 122-945%

(afhængig af metallet) højere ved lav temperatur, hvilket skyldes blåmuslingens øgede

(16)

fødeassimilationsrate ved lav temperatur (Baines et al. 2005). Endvidere var udskillelsesraten lavere ved 2°C (50-80%) end ved 12°C på grund af nedsat respiration (Baines et al. 2005). Disse temperatureffekter kan have stor indflydelse på organismers bioakkumulering af tungmetal fra føde og bør inddrages som faktor, når man vurderer udledte tungmetallers toksicitet for flora og fauna i forskellige miljøer (Baines et al. 2005).

Nogle organismer er aktivt i stand til at udskille tungmetaller fra vævet, men det er muslinger generelt ikke (Depledge & Rainbow 1990). Fordøjelseskirtlen (hepatopankreas) er hos M.

galloprovincialis vist at optage og binde tungmetaller, hvormed stofferne uskadeliggøres. Organet spiller derved en vigtig rolle i tungmetalmetabolismen (Viarengo et al. 1981), hvilket sandsynligvis også gør sig gældende hos M. edulis. Flere transplantationsstudier i Grønland har vist, at blåmuslingen frigiver bly langsomt efter kontaminering (Riget et al. 1997, Søndergaard et al. 2011, Zimmer et al. 2011), hvilket kan skyldes langvarig akkumulering i fordøjelseskirtlen. Riget et al.

(1997) viste eksempelvis, at blykontaminerede blåmuslinger fra Maarmorilik overført til et ukontamineret område i løbet af det første år nedsatte blyindholdet fra 744 til 400 µg/g tørvægt, hvorefter koncentrationen forblev konstant de næste fire år. Blyindholdet i det enkelte individ kan således kun mindskes ved fortynding og/eller fysiologisk udskiftning af væv, efterhånden som muslingen vokser (Zimmer et al. 2011). Dette kan øge de langsigtede økologiske konsekvenser af tungmetalforurening for blåmuslingen.

Cellemembraner  hos  ektotermer  stresses  af  kulde  og  bly  

Dette afsnit er et teoretisk overblik over cellemembranens fysiske og fysiologiske egenskaber og hvorledes denne stresses af både tungmetal og kulde, hvilket lægger til grund for studiets hypotese om, at den mulige synergi imellem effekterne af kulde og bly på blåmuslingens kuldetolerance skyldes ændringer i membranens fedtsyrekomposition.

 

Cellemembranen  

Alle celler er omgivet af en semipermeabel membran, der virker som barriere til det omgivende miljø. Membranens funktionalitet er afgørende for cellens (og organismens) overlevelse, da cellemembranen gør det muligt for cellen at kontrollere sit indre miljø (Singer & Nicolson 1972, Hazel & Williams 1990). En cellemembran er en dynamisk todimensionel lagdelt struktur bestående af orienterede lipider med indlejrede transportproteiner, der tillader effektiv transport af

(17)

udvalgte molekyler og ioner (Figur 6) (Singer & Nicolson 1972). I cellemembranen findes primært tre lipidtyper; kolesterol, glykolipider og fosfolipider, hvoraf den sidstnævnte er dominerende (Berg et al. 2007). Et fosfolipid består typisk af glycerol esterbundet til to fosfolipidfedtsyrer (PLFAs) samt en fosfatgruppe. På fosfatgruppen er der endvidere esterbundet en alkohol. PLFAs er hydrerede kulstofkæder af varierende længde med en terminal carboxylsyregruppe. Fosfolipider er således amfipatiske molekyler med en upolær hale bestående af PLFAs samt et polært hoved.

Denne amfipatiske struktur er afgørende for fosfolipiders spontane formation til en membran i et hydrofilt miljø, hvor PLFAs pakkes tæt sammen via nonkovalente hydrofobe bindinger (Figur 6) (Singer & Nicolson 1972, Berg et al. 2007).

                               

 

Figur  6  viser  strukturen  af  et  fosfolipid-­‐molekyle  og  cellemembranen.  (a)  Et  fosfolipidmolekyle  består  af   en   upolær   hale   i   form   af   to   fedtsyrer   (PLFAs)   samt   et   polært   hoved,   hvilket   giver   molekylet   dets   amfipatiske   natur.   PLFAs   er   lange   carbonkæder   mættet   eller   umættet   med   hydrogen.   Dobbeltbindinger   imellem  carbon-­‐atomerne  giver  PLFA  et  knæk.  PLFAs  er  esterbundet  til  et  polært  hoved,  der  består  af  et   glycerolmolekyle   esterbundet   til  en  fosfatgruppe,  som   igen   er   esterbundet   til  en   alkohol,   her   cholin.  (b)   Fosfolipidernes   amfipatiske   natur   gør,   at   de   spontant   samler   sig   til   en   bimolekylær   struktur   med   et   hydrofilt   ydre   og   et   hydrofobt   indre.   Indlejrede   transportproteiner   er   ikke   vist.   Fra   http://chemistry.tutorvista.com/biochemistry/phospholipids.html    

 

(18)

Cellemembranens  temperatursensitivitet  

Cellemembranens funktionalitet, herunder membranens fluiditet og fasetilstand, er sensitiv overfor temperaturændringer (Hazel & Williams 1990). Temperaturen, hvor membranen abrupt går fra en funktionel flydende-krystallin fase til en dysfunktionel stiv gelfase kaldes fasetransitionstemperaturen (Tm). Fasetransitionen ændrer i høj grad membranens fysiske organisering og således dens fysiologiske egenskaber (Hazel & Williams 1990).

Det mest observerede cellulære respons til temperaturændringer hos ektotermer er regulering af cellemembranen (Hazel & Williams 1990). Dette sker på flere måder. Kolesterol regulerer fluiditeten i animalske membraner og herved også Tm (Crockett 1998, Berg et al. 2007). Et øget kolesterolindhold giver rigiditet til membranen og mindsker endvidere risikoen for transition til gelfase, der ellers kan medføre en række forstyrrelser af membranen (Seelig 1978, Quinn 1985, Hazel 1995). Sammenligninger af kolesterolindhold i akklimatiserede (og akklimerede) ektotermer viser et stigende kolesterolindhold ved stigende temperatur (Crockett 1998). Endvidere afhænger Tm af egenskaber ved PLFAs. PLFAs er en divers gruppe af molekyler med meget forskellige kemiske og fysiske egenskaber (Hazel & Williams 1990, Berg et al. 2007). Både længde samt antal og placering af cis carbon-carbon dobbeltbindinger er afgørende for de enkelte PLFA’s smeltepunkt og således for membranens overordnede Tm (Figur 6). Lange PLFAs interagerer kraftigere med hinanden end korte, hvorfor lange PLFAs relativt til korte øger Tm. Ligeledes øger mættede PLFAs Tm, da disse er lige molekyler, der pakkes helt tæt og interagerer effektivt med nabomolekyler.

Modsat sænker umættede PLFAs Tm, særligt flerumættede fedtsyrer (PUFAs), da dobbeltbindinger giver PLFAs et knæk, hvormed pakningen af PLFAs bliver mere løs og dermed relativt svagere (Wang et al. 1999, Berg et al. 2007). Således korresponderer højere Tm værdier med højere grad af orden i pakningen af PLFAs (Separovic & Gawrisch 1996).

Kulde  stresser  membranen  hos  ektoterme  organismer  

Ektoterme organismer har samme kropstemperatur som omgivelserne og har derfor varierende kropstemperatur over året og døgnet. Omgivelsernes temperatur er således af afgørende fysiologisk og økologisk betydning for disse organismer (Cairns et al. 1975, Hazel & Williams 1990, Pernet et al. 2007). I den arktiske tidevandszone indtræffer daglige temperaturfluktuationer som følge af tidevandets cyklus. Her når ektoterme organismers kropstemperatur ned på lave frysegrader. Kulde stresser biologiske membraner, som er det primære sted for kuldeskade hos invertebrater (Aarset 1982, Hazel & Williams 1990). Kuldechok, hvor organismer kortvarigt udsættes for lav temperatur,

(19)

kan enten have umiddelbar død eller kroniske skader på muskler og nervesystem som følge. Det menes at være resultatet af, at membranen overgår til den dysfunktionelle gelfase, hvor membranen eksempelvis ikke kan opretholde vitale iongradienter (Quinn 1985, Kelty et al. 1996).

Inden for de genetiske rammer er det muligt for et individ at akklimatisere sig til foranderlige temperaturforhold (Aarset 1982, Heugens et al. 2001). Mange ektoterme dyr er endvidere adapteret til temperaturvariationer, således at fysiologiske processer kan forløbe effektivt over et relativt bredt temperaturspektrum (Crockett 1998). Den mest almindelige tilpasning til temperaturændringer er regulering af cellemembranen. Dette fænomen kaldes homeoviskøs adaption. Ektoterme dyr regulerer primært membranen ved at regulere membranens PLFA komposition og dermed membranens grad af orden (Hazel & Williams 1990, Hazel 1995). Denne membranregulering som respons på temperaturændringer er observeret hos flere ektoterme tidevandsarter (Hall et al. 2002, Pernet et al. 2006, Pernet et al. 2007), endda indenfor få timer hos M. californianus samlet øverst i tidevandszonen (Williams & Somero 1996).

Når ektoterme organismer udsættes for kulde øges graden af umættethed (primært PUFAs) i membranen for at sænke Tm og dermed opretholde en funktionel fluiditet ved lav temperatur (Hazel 1995). Dette er eksempelvis påvist hos gællevæv fra henholdsvis blåmusling og østers (Crassostrea virginica). Begge arter viste en signifikant relation imellem den overordnede grad af umættethed i membranen og akklimatiseringstemperatur (Pernet et al. 2007). En øget grad af umættethed øger overlevelsen ved kolde temperaturer (Hazel & Williams 1990, Hazel 1995) og særligt et forøget PUFA indhold ses i de mest kuldetolerante organismer (Hazel 1988). I henhold til dette observerede Pernet (2007), at blåmuslingen havde en højere grad af umættethed og PUFA i sine cellemembraner end østers, der er en mindre kuldetolerant art.

 

Peroxidering  af  cellemembranen  

Som ovenfor beskrevet stresses cellemembranen hos ektoterme dyr af kulde. Alle organismer er endvidere kontinuerligt udsat for oxidativt stress forårsaget af reaktive oxygenarter (ROS). ROS skabes ved en ufuldstændig reduktion af ilt (O2)(Livingstone et al. 1990). Som forsvar har alle organismer et antioxidantsystem, der nedbryder ROS (Sukhotin et al. 2002).

Peroxidering betyder oxidering af lipider og er en skadelig proces, hvor ROS oxiderer og degraderer membranlipiderne, hvilket resulterer i effekter varierende fra lokale ændringer i membranfluiditeten til celledød (Marcelo 2004, Valko et al. 2005). Den mest almindelige ROS til

(20)

peroxidering anses for at være OH- (Nyska & Kohen 2002, Marcelo 2004). Peroxidering initieres ved, at OH- abstraherer H+ fra en methylengruppe ved siden af en dobbeltbinding i en umættet PLFA. Herved dannes en fedtsyreradikal (Figur 7.1). PUFAs er meget følsomme overfor peroxidering, da C=C

dobbeltbindingen gør C-H bindingen i methylengruppen svag og derfor mere følsom overfor oxidering (Nyska &

Kohen 2002, Valko et al. 2005).

Den dannede fedtsyreradikal reagerer med omgivende O2 og danner en lipoperoxyl radikal (Figur 7.2). Denne er ligeledes meget reaktiv og kan reagere med et nabo-PUFA molekyle, hvormed der dannes en lipidhydroperoxid. Samtidig omdannes nabo-PUFA til en fedtsyreradikal, der kan indgå i samme reaktionskæde (Figur 7.3). Lipidhydroperoxid reagerer eventuelt med Fe2+, men

undergår under alle

omstændigheder degradering

(Figur 7.4 og 7.5). Peroxidering af én PUFA via ROS igangsætter altså en autokatalytisk proces i membranen, hvor PUFAs nedbrydes, indtil der ikke er flere eller indtil en antioxidant bremser kædereaktionen (Nyska & Kohen 2002, Marcelo 2004, Valko et al. 2005).

Bly  øger  peroxidering  og  stresser  membranen  

Det er velkendt, at mange tungmetaller kan inducere produktionen af ROS og øge peroxidering (Christie & Costa 1984, Viarengo et al. 1990, Valko et al. 2005). Flere studier har vist, at bly øger peroxidering i både planter og dyr (Gerber et al. 1978, Shafiq Ur 1984, Lawton & Donaldson 1991,

Figur   7   viser   peroxidering   af   flerumættede   fedtsyrer   (PUFAs)   ved   eksponering   til   reaktive   oxygenarter.   Se   tilhørende   tekst   for   detaljer.  

Efter  Marcelo  (2004)  

(21)

Stohs & Bagchi 1995, Verma & Dubey 2003). Blykontaminering er generelt forbundet med en dosisafhængig stigning i peroxidering og mange af blys toksiske effekter synes at være forbundet med ændringer i membranens PLFAs (Donaldson & Knowles 1993).

Geret et al. (2002) har vist, at flere tungmetaller (Ag, Cd og Hg) signifikant øger peroxidering i blåmuslingen. I henhold til dette viste studiet endvidere, at tungmetaleksponeringen inducerede produktionen af proteinet metallothionein (MT) (Geret et al. 2002). MT binder overskydende metalioner i vævet (sekvestrering) og regulerer således indirekte peroxidering (Geret et al. 2002).

Desuden har MT en direkte antioxidant virkning, da proteinet binder og uskadeliggør OH- (Thornalley & Vasak 1985). Af disse grunde kan MT anvendes som indikator på biologiske effekter af tungmetalkontaminering (Schiedek et al. 2009). Blåmuslinger fra Maarmorilik kontamineret med høje blykoncentrationer (>100 x baggrundsniveau) er ligeledes vist at have et øget MT indhold (Schiedek et al. 2009).

Viarengo et al. (1991) har vist, at blåmuslingen har et lavere antioxidantniveau om vinteren.

Dette kan skyldes den ektoterme organismes nedsatte metabolisme eller at fysiologisk antioxidantproduktion kræver energi. Blåmuslingen i Arktis er ofte begrænset af fødetilgængelighed, særligt i de mørke vintermåneder, hvor produktionen af fytoplankton stort set går i stå på grund af lysmangel (Sejr, pers. komm.). Den observerede reduktion i antioxidantniveauet blev tilsvaret af en øget peroxidering af cellemembranerne. Længerevarende lave vintertemperaturer øger ifølge dette studie således indirekte peroxidering og mindsker dermed potentielt mængden af PUFA. (Viarengo et al. 1991).

Synergetisk  stressinteraktion  mellem  kulde  og  tungmetal  

I 1984 fremsatte Environmental Protection Agency (EPA) risikovurderingsprocedurer til at vurdere og minimere risikoen af forskellige giftige stoffer i miljøet (EPA 1984). Disse danner baggrund for undersøgelser af forskellige stoffers toksicitet og letale koncentration ud fra standardiserede økotoksikologiske laboratorietests, hvor alle andre parametre end stofkoncentrationen holdes konstante (og typisk favorable) for testorganismen (Løkke et al. 2013).

Det kan dog være problematisk at ekstrapolere resultaterne fra laboratoriet til det naturlige miljø, hvor organismer sjældent oplever optimale forhold og oftest er udsat for flere stressfaktorer ad gangen (Holmstrup et al. 2010).

(22)

Når flere former for stress interagerer og simultant påvirker en organisme, kan det resultere i synergetisk stress (figur 8). Det betyder, at den kombinerede stresseffekt er større end de adderede effekter af de enkelte stressfaktorer. Der tages ikke højde for synergetiske interaktioner med andre stressfaktorer eller for subletale effekter, hvis man vurderer toksiciteten af et stof i et som ovenfor beskrevet standard- laboratorieforsøg (Holmstrup et al. 2010).

Eftersom den omgivende temperatur hos ektoterme organismer påvirker visse fysiologiske processer, forventes en synergetisk interaktion med et toksisk stof, der påvirker de samme fysiologiske processer (Heugens et al. 2001). I henhold til dette kan metalkontaminering mindske organismens tolerance overfor ekstreme temperaturer og omvendt (Ansari et al. 2004), eftersom både tungmetal og kulde stresser cellemembraner. Synergetisk stresspåvirkning af kulde og tungmetal er ikke et velstuderet område, men fokus på interaktioner imellem kemisk og

fysisk stress er dog øget i det seneste årti, primært på grund af klimaforandringer (EPA 2003, Noyes et al. 2009, Hooper et al. 2013, Løkke et al. 2013). Synergi imellem kulde og tungmetal er blevet undersøgt hos nogle få terrestriske arter, men ikke marine arter. Bindesbøl et al. (2009a) viste eksempelvis, at både nikkel (Ni) og kviksølv (Hg) interagerede synergetisk med kuldestress (-6°C) på frysetolerancen hos regnorm (Dendrobaena octaedra). Bly havde derimod ingen interaktion med kuldestress i dette studie, sandsynligvis på grund af for lave anvendte blykoncentrationer (ingen mortalitet af bly i kontroller uden fryseeksponering) (Bindesbøl et al. 2009a). Holmstrup et al. (2008) har som et andet eksempel vist en signifikant synergetisk interaktion imellem kviksølv og kuldechok på springhaler (Folsomia candida). Studiet viste, at LT50 under kontrolforhold (ingen Hg) var -6°C. Med stigende subletale kviksølvkoncentrationer øgedes LT50 gradvist til -2°C.

Figur   8   viser   et   skematisk   eksempel   på   en   synergetisk   interaktion   imellem   en   kemisk   og   en   fysisk   (”natural”)   stressfaktor.   (A)   viser,   at   en   organismes   performance   falder,   når   et   kritisk   stressniveau   nås,   altså   hvor   organismen   ikke   længere  kan  kompensere  for  de  negative  effekter  af   en   naturlig   stressfaktor.   (B)   viser,   at   ved   tilstedeværelsen   af   en   kemisk   stressfaktor   indtræffer  dette  kritiske  stressniveau  ved  en  lavere   grad  af  fysisk  stress.  Efter  Løkke  (2013).  

(23)

Omvendt øgede kuldechok toksiciteten af kviksølv, således at kviksølvkoncentrationer, der under kontrolforsøg med optimale temperaturforhold ikke havde haft letale effekter, fik det. På baggrund af deres resultater påpegede Holmstrup et al. (2008) risikoen for at undervurdere tungmetallers toksicitet med laboratorieforsøg, hvor organismer kun udsættes for én stresspåvirkning ad gangen (Holmstrup et al. 2008). Også kobber (Cu) er vist at interagere synergetisk med kuldestress på frysetolerance hos flere arter (Holmstrup et al. 1998, Bossen 2001). Bindesbøl et al. (2005) viste eksempelvis en signifikant synergetisk interaktion imellem subletale kobberkoncentrationer og kuldestress hos regnorm (D. octaedra) fra Grønland og konkluderede derfor, at kobberforurening er af betydning for regnormens biogeografi (Bindesbøl et al. 2005). Et senere studie af samme gruppe har vist, at kobbers skadelige effekt på regnormens kuldetolerance skyldes tungmetallets toksiske effekt på cellemembranerne, da gruppen fandt et signifikant fald i PUFAs samt et signifikant øget peroxideringsniveau ved kobbereksponering (Bindesbøl et al. 2009b). Flere andre studier viser ligeledes, at den synergetiske interaktion imellem tungmetal og kuldestress på kuldetolerance (delvist) skyldes membranskader (se Holmstrup 2010 for review).

Aktuelt  studie  

Dette afsnit opsummerer, hvorledes den ovenstående teoretiske introduktion danner baggrund for det aktuelle videnskabelige studie, som manuskriptet omhandler.

I de seneste årtier er der kommet øget fokus på tungmetalforurening af marine miljøer. Store mængder af tungmetal er udledt til havet, og dette forventes at fortsætte i fremtiden. Udledte tungmetaller vækker stor bekymring grundet deres akkumulering i sediment og i marine organismer samt stoffernes potentielle toksiske (sub-)letale effekter (Ansari et al. 2004). Særligt marine områder nær minedrift er kraftigt kontaminerede med tungmetaller såsom bly.

Blåmuslinger i den arktiske tidevandszone udsættes for ekstremt lave lufttemperaturer i vintermånederne (Scrosati & Eckersley 2007, Blicher et al. 2013). I kontaminerede grønlandske fjordsystemer er de samtidig udsat for høje blykoncentrationer (Johansen et al. 2008, Bach, pers.

komm.). Lave temperaturer udøver stress på cellemembranerne hos ektoterme organismer, da membranen kræver en vis fluiditet for at være fuldt funktionel. Kommer temperaturen under fasetransitionstemperaturen Tm går membranen i en dysfunktionel stiv gelfase (Hazel & Williams 1990). Bly stresser cellemembranen ved at øge peroxidering, som kan mindske mængden af

(24)

PUFAs. Færre PUFAs øger generelt Tm, da membranen bliver mere rigid og derfor kræver en højere temperatur for at holdes flydende.

Eftersom både kulde og bly stresser biologiske membraner, kan bly potentielt gøre organismer meresårbare overfor kulde og omvendt (Heugens et al. 2001). En sådan synergetisk interaktion af tungmetal og kulde er tidligere påvist hos flere terrestriske organismer, men ikke hos marine arter (Bindesbøl et al. 2005, Holmstrup et al. 2008, Bindesbøl et al. 2009a, b). Disse synergetiske stressinteraktioner er generelt vigtige at forstå, før man ekstrapolerer resultater fra laboratoriet til naturen. En subletal blykoncentration i laboratoriet kan have letale konsekvenser i det naturlige økosystem, hvor flere stressfaktorer simultant interagerer på organismens fitness (Heugens et al.

2001).

Det er således hypotesen i dette studie, at der er en synergetisk interaktion mellem effekterne af henholdsvis bly i økologisk realistiske koncentrationer og økologisk realistisk kulde på blåmuslingens kuldetolerance i Arktis. Dette undersøges i et fuld-faktorielt forsøg, hvor blåmuslinger indsamlet i tidevandszonen i Nuuk, Grønland (maj 2014), udsættes for 5 blykoncentrationer og 6 temperaturer (figur 9-11). Som mulig forklaring herpå undersøges det, hvorvidt den potentielle synergetiske interaktion skyldes, at bly skader membranen via ændringer i PLFA kompositionen grundet øget peroxidering.

Figur   9.   Blåmuslinger   samlet   i   Nuuk,   Grønland,   kontamineres   med   forskellige   blykoncentrationer  i  en  uge.  

Figur  10.  100  blåmuslinger  tørres  enkeltvist   inden  blyanalyse  af  vævet.  

(25)

Blåmuslingen anvendes som testorganisme, da den er en velstuderet og hyppigt anvendt miljøindikator. Der findes således en baggrundsviden om denne art, også fra arktiske lokaliteter. Bly undersøges af flere grunde: (1) bly er en kilde til bekymring i arktiske marine miljøer, eftersom bly fortsat findes i høje koncentrationer i visse arktiske fjordsystemer; (2) bly har toksiske effekter ved både letale og subletale koncentrationer (AMAP 2005, Liu et al. 2011, Ouyang et al. 2012, Liu et al. 2014) og (3) bly bioakkumuleres og øger cellulær peroxidering. Desuden forventer man flere blyminer i Grønland i fremtiden (Rosing et al. 2014), som kan forårsage yderligere blyforurening. Bly og kuldes mulige synergetiske interaktion på blåmuslingens frysetolerance er yderst relevant at undersøge, da et positivt resultat kan indebære, at man ikke kan vurdere blys toksicitet alene ud fra standardiserede økotoksikologiske laboratorietests. Yderligere bør man i så fald overveje, om man kan overføre europæiske grænseværdier1 for bly i marine miljøer til Arktis, da arktiske organismer udsættes for ekstrem kulde. Synergetiske interaktioner angående kuldetolerance gør sig potentielt gældende for en række andre arter og tungmetaller. Det er kritisk at forstå disse toksiske stoffers interaktion med andre former for stress (i Arktis særligt kuldestress) for at kunne vurdere risikoen for det arktiske marine økosystem i forbindelse med de antropogene tungmetaludledninger, som vi forventer vil fortsætte i fremtiden.

                 

                                                                                                               

Figur  11.  PLFA  komposition  af   100  blåmuslinger  analyseres.  

(26)

                                                                                   

(27)

Manuscript

A  test  of  possible  synergetic  

interactions  between  sub-­‐zero  temperatures  and   lead  (Pb)  contamination  in  Greenland  blue  mussel  

(Mytilus  edulis).  

(28)

Authors and addresses

Bodil Klein Juhl1, Jakob Thyrring1*, Martin Holmstrup1,2, Mikael K. Sejr1,3

1Department of Bioscience, Aarhus University, Arctic Research Centre, C. F. Møllers Allé 8, building 1110, DK-8000 Aarhus C, Denmark

2Department of Bioscience, Aarhus University, Soil Fauna Ecology and Ecotoxicology, Vejlsøvej 25, DK-8600 Silkeborg, Denmark

3Greenland Climate Research Centre, Greenland Institute of Natural Resources, Nuuk, Greenland

*Corresponding author: thyrring@bios.au.dk; phone: +45 87156697

Keywords

Arctic, Freeze tolerance, Freezing, Mining, membrane lipids; PLFA, Risk assessment

     

     

 

     

(29)

Abstract    

In their natural habitat, organisms are exposed to multiple stressors. Previous studies have shown, that interactions between chemical and physical stressors can lead to increased mortality.

Heavy metal contamination stresses the cell membrane due to increased peroxidation. Likewise, sub-zero temperatures also potentially reduce membrane functionality. We conducted a full factorial experiment with 5 Pb concentrations between 0 and 6.50 mg Pb/L and 6 temperatures from 0 to -17ºC to test the hypothesis that environmentally realistic levels of Pb may interact synergetically with realistic sub-zero temperatures on the freezing mortality of the blue mussel (Mytilus edulis) collected in Nuuk, Greenland. We further investigated whether these interactions are due to Pb-induced alterations of PLFA composition and membrane damage. We found a highly significant interaction between temperature and mortality, however no effect of lead was seen. Nor a significant interaction between temperature and Pb on mortality of blue mussels was found, but a trend was observed at intermediate sub-zero temperatures with increased freezing mortality with increasing Pb concentrations. At low temperature, ectothermic organisms will regulate the composition of phospholipid fatty acids (PLFAs) typically by increasing the amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) of the cell membrane to sustain a proper fluidity and functionality. Pb had a significant effect on the molar percentage of PUFAs, which was reduced from 72.3% (control) to 70.8% in mussels exposed to the highest Pb concentration. Also a significant increase in monounsaturated fatty acids (MUFAs) was observed, in particular due to an increase in 18:1. Further, blue mussels exposed to the highest Pb concentrations (4.50 and 6.50 mg Pb/L) had a significantly higher !"#$!"#$ ratio compared to controls and mussels exposed to the lowest Pb concentration (0.50 mg Pb/L). The overall unsaturation index was not significantly related to Pb concentration. Thus, this study revealed significant effects of sub-lethal concentrations of the hazardous heavy metal Pb on a cellular level in blue mussels. A biochemical background for a decreased freezing tolerance over time is possibly observed as Pb significantly decreases PUFA content. This and other studies indicate that synergetic interactions between physical and chemical stressors should be considered in future risk assessments of heavy metal contamination of natural habitats.

(30)

1.  Introduction

Declining sea ice cover and political and economical interests in the vast potential of oil and hard mineral reserves in the Greenlandic underground are all drivers for Greenland’s aspirations concerning the future exploitation of mineral recourses, including iron (Fe), gold (Au), zinc (Zn), lead (Pb), gas and oil (Nuttall 2014, Rosing et al. 2014).

In Greenland, mining activities have been conducted for over a century with well-documented long-term environmental impacts, including heavy metal contamination of fjords and organisms (Søndergaard et al. 2011, Søndergaard et al. 2014). For example, at an abandoned mining site in South-Greenland, Johansen et al. (2008) found Pb concentrations in blue mussels (Mytilus edulis) elevated to 200-500 times above background concentration, and Loring & Asmund (1989) reported Pb tissue concentrations exceeding 800 µg/g (background 3 µg/g) in mussels collected close to the Maarmorilik mine in West Greenland. Because of previous environmental contamination, recent oil and mineral exploration in the Arctic region have lead to growing concerns about uncontainable pollution of the Arctic marine ecosystems (AMAP 2010). Heavy metal waste from increasing mining activities is an environmental threat due to potential pollution and contamination of the sensitive marine flora and fauna (Reichelt-Brushett 2012, Søndergaard 2013).

In the Arctic, contaminated organisms simultaneously get exposed to multiple stressors, both chemical and physical. Chemical contamination may under some conditions reduce the cold tolerance of invertebrates, leading to increased mortality when low temperature is combined with contamination (Holmstrup et al. 2008, Bindesbøl et al. 2009a, b). Still, in traditional ecotoxicological laboratory studies organisms are usually exposed to a single chemical, while held at otherwise optimal conditions. Risk-assessment and environmental monitoring methods often consist of point sampling and transplant studies with the focus of estimating uptake/release rates of contaminants, mortality and metal tissue content (Søndergaard et al. 2011, Zimmer et al. 2011).

However, such studies have limitations, as they do not consider synergetic stress interactions of multiple stressors acting simultaneously on organisms in natural environments. Both physical and chemical stressors can interact synergetically and in the Arctic, extreme temperatures, increasingly acidic oceans (AMAP 2013), additive effects of multiple contaminants, food scarcity during winter and other relevant stressors are factors worth considering when conducting risk assessment in this region. Also, such traditional studies often do not include sub-lethal effects. Sub-lethal concentrations of metals may affect growth, and enzyme activities of plants and animals (Naimo 1995, Ouyang et al. 2012). Consequently, as both chemical and physical induced stress is known to

(31)

have chronic and (sub)-lethal effects, multi-factorial studies investigating synergetic interactions between multiple stressors are crucial to incorporate in future risk-assessments of chemicals in the Arctic (Heugens et al. 2001).

In marine environments a number of species are frequently included when conducting risk- assessments (Søndergaard et al. 2014). One key indicator organism is the blue mussel (M. edulis) because it is relatively long-lived, sessile and abundant with potential for concentrating and assimilating metals directly from seawater and suspended particles (Zimmer et al. 2011, Søndergaard et al. 2014). In subarctic Greenland, intertidal blue mussels are widely distributed (Blicher et al. 2013). Here they create unique habitats with a rich associated fauna and they are an important food source for higher trophic levels such as fish, sea birds and mammals (Gosling 2003).

In the intertidal zone, sub-zero air temperatures are a primary factor influencing blue mussels distributions-patterns (Blicher et al. 2013). With minimum winter temperatures down to -25ºC (Blicher et al. 2013), cold stress and freezing mortality is common among intertidal blue mussels in the Arctic region (Bourget 1983). When acclimatizing to sub-zero temperatures, ectotherms modify the lipid composition of their cell membrane. The phase behaviour and physical properties of membrane phospholipid fatty acids (PLFAs) are extremely sensitive to temperature changes (Hazel

& Williams 1990). Fully functional membranes are in a liquid-crystalline phase, but if membranes are cooled to a threshold temperature [the phase-transition-temperature (Tm)], the membrane enters a dysfunctional rigid gel phase (Hazel 1995). To lower Tm and thereby ensure the proper fluidity at low temperatures, ectotherms regulate cholesterol content and the proportion of unsaturated fatty acids, mainly they up-regulate the content of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) (Cossins &

Raynard 1987, Hazel 1995). Such changes in cell membrane PLFA composition are probably important for freeze tolerance in cold adapted ectothermic animals (Hazel 1995, Kostal et al. 2003).

When blue mussels are exposed to sub-zero temperatures (approximately -7°C depending on body size (Sejr, unpublished data)), ice forms in extracellular fluids. Since only water molecules form the ice, the concentration of extracellular solutes increases. This causes cells to dehydrate as intracellular water moves down the osmotic gradient into the extracellular space. Excessive cell dehydration is lethal as it disrupts membrane function and protein structures (Meryman 1971). To increase freezing tolerance, blue mussels change the intracellular free amino acid concentration, altering the freezing point of intracellular fluids and preventing an intolerable degree of dehydration (Williams 1970, Aarset 1982).

(32)

When the hazardous heavy metal lead (Pb) is released into marine environments, it may be assimilated into marine organisms. Filter-feeding bivalves are exposed to large quantities of water during feeding and respiration, and in this process they accumulate Pb in both soft tissues and the shell (Sericano 2000). On a cellular level, Pb contamination has been shown to cause mitochondrial swelling, deformation and decreased membrane permeability (Goyer & Krall 1969, Raghavan et al.

1981). Heavy metal contamination with various metals has been demonstrated to increase reactive oxygen species (ROS) production, which accelerates lipid peroxidation, destabilises cell membranes and alternate PLFA composition (Christie & Costa 1984, Gallego et al. 1996, Valko et al. 2005). Increased ROS production has also been demonstrated with Pb contamination (Lawton &

Donaldson 1991, Verma & Dubey 2003). ROS affects both monounsaturated (MUFAs) and polyunsaturated fatty acids, but PUFAs are particularly susceptible to oxidation by ROS (Nyska &

Kohen 2002). PUFAs are vulnerable to peroxidation since double bonds weaken the adjacent monoallylic C-H bonds and facilitate the reaction of –H with an oxidizing agent, resulting in lipid radicals and eventually lipid chain termination (Marcelo 2004). Lipid peroxidation will hereby alter the overall degree of unsaturation from a highly polyunsaturated cell membrane to a more ordered and rigid membrane structure. This would in theory increase the phase-transition-temperature (Tm) of the membrane, which leads to a local reduction in membrane fluidity (Hazel & Williams 1990).

If ambient temperature decreases to Tm it can lead to a loss of vital functions and selective properties (Hazel & Williams 1990). Since both sub-zero temperatures and Pb possibly stress cell membranes by making it inadequately fluid for full functioning, a synergetic effect of these stressors can possibly exist.

In the present study we test the hypothesis that synergetic interactions between Pb at ecological relevant tissue concentrations and realistic sub-zero air temperatures will increase mortality due to freezing in the arctic blue mussel. Further, to understand the importance of altering cell membrane fluidity in the freezing tolerance strategy of blue mussels, we test the possibility that Pb contamination destabilizes the cell membrane by modifying the PLFA composition, and hereby cause blue mussels to become more vulnerable to the sub-zero temperatures of the arctic intertidal zone.

(33)

2.  Materials  and  Methods  

2.1  Animals  and  holding  conditions  

We used blue mussels (Mytilus edulis) of similar size (~3 cm) collected in the intertidal zone of Kobbefjord near Nuuk, subarctic Greenland (64°N) in May 2014. Collected animals were immediately transferred to aerated tanks before transported to holding facilities at Aarhus University, Denmark. Blue mussels were kept in 40 L aquariums of constant salinity (27 PSU) and temperature (1ºC). Animals were allowed to acclimate to laboratory conditions for seven days before experiments were conducted. Mussels were fed with commercially available phytoplankton mix (Reed Mariculture, Shellfish Diet – 1800 Formula, Campbell, CA, USA). Half the water volume was daily exchanged with fresh filtrated seawater to minimise build-up of pseudofeces and excretion products.

2.2  Experimental  design  

A full factorial experimental design was used to determine survival after exposure to six sub- zero air temperatures (0, -7, -8, -11, -14, -17ºC) and five Pb concentrations (0, 0.50, 1.80, 4.50 and 6.50 mg Pb/L seawater), giving a total of 30 treatments including control groups.

Pb contaminated seawater was made using a stock solution (10 g Pb/L) made from the analytical salt lead(II)nitrate [Pb(NO3)2] and deionised water. Mussels were exposed to water concentrations of 0, 0.50, 1.80, 4.50 and 6.50 mg Pb/L seawater for seven days at 5ºC prior to the freezing experiment. Water was aerated by air pumps and changed every 24 hours. After seven days of exposure, 15 mussels were randomly allocated to every experimental combination of Pb and temperature (a total of 450 mussels). To simulate aerial exposure in the arctic intertidal zone, mussels from each Pb treatment were transferred to a freezing cabinet (WTB Binder Labortechnik, Tuttlingen, Germany) programmed to gradually lower the temperature from 5ºC to experimental temperature over 45 minutes. Mussels were kept at the target temperature (±0.5ºC) for 60 minutes before a gradual increase of temperature to 5ºC over 45 minutes was initiated. All mussels were then returned to holding aquariums (5ºC) to recover.

Survival rates were assessed after 1 and 24 hours, respectively, using tactile stimuli and cardio activity as indicators of survival (using infrared sensors) (Aarset 1982, Burnett et al. 2013).

Mussels were considered alive if they reacted to tactile stimuli and had cardio activity. The mussels

(34)

were finally frozen and stored at -80ºC until further analysis of tissue Pb content and phospholipid fatty acid (PLFA) composition.

2.3  Pb  analysis    

We randomly sampled 20 mussels from each Pb treatment for analysis of Pb tissue content and PLFA composition. Approximately 10 mg (fresh weight) of gill tissue was dissected out and stored at -80ºC for PLFA analysis. Remaining tissue was dried for 24 h (60ºC) and acid-digested in 65%

nitric acid at increasing temperatures (80-110ºC) until all fluid had evaporated. Tissue was then re- dissolved in 6 mL 2% nitric acid and whirly mixed until clear. Pb content was analysed using flame atomic absorption spectrometry (AAS) (Perkin-Elmer 4100, Ueberlingen, Germany). Certified reference material (lobster hepatopancreas from National Research Council Canada) was used to verify the analytical quality, resulting in a measured concentration of 139% (± 7.83% SE, N = 5) of the certified value.

2.4  PLFA  analysis  

All gill tissue (see above) was transferred to centrifuge glass tubes and extracted with a mixture of 1.5 mL chloroform, 1.25 mL buffer (50 mM K2HPO4,pH 7.4) and 3 mL methanol (Waagner et al. 2013). The chloroform phase containing lipids was transferred to a test tube and evaporated under nitrogen flow. Lipid extract was dissolved in 300 µL chloroform and fractionated on prepacked columns with 100 mg of silic acid (Bond Elut Extraction Cartridges, Varian US). PLFAs were extracted from the column using 1.5 mL methanol and dried under nitrogen flow. Collected PLFAs were trans esterified by mild alkaline methanolysis (Dowling et al. 1986). Heptane, ELGA water, and acetic acid (1 M) (1:1:0.15 v/v/v) were added. The biphasic mixture was whirly mixed and centrifuged for 5 min at 1500 g. The heptane phase containing the fatty acid methyl esters (FAMEs) was collected. Extraction with heptane was repeated. Combined heptane fractions were dried under nitrogen flow. Resulting FAMEs were re-dissolved in heptane for gas chromatographic analysis coupled with mass spectrometry on a Shimadzu GCMS-QP2010 Plus. Identification of individual FAMEs was based on mass spectra of known FAME standards (Nu-check Prep, Elysian, MN, USA). Identified fatty acids were designated as X:Y, where X is the number of carbon atoms and Y is the number of double bonds. Areas of identified peaks were quantified using external standards, and mol% distributions were calculated(Waagner et al. 2013).

(35)

2.5  Statistical  analysis    

We used one-way analysis of variance (ANOVA) to test for differences in the relative amounts of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), monounsaturated fatty acids (MUFAs) and the !"#$!"#$

relationship among Pb treatments. Post-hoc pair-wise (Tukey HSD) tests were used to compare significant treatment effects (p < 0.05). Finally, generalized linear models (GLM) were used to model the effects of temperature and Pb and any interactions between the two on survival.

Prior to any analysis, data exploration was carried out following the protocol of Zuur et al. (2010).

Relationships between covariates were assessed using Pearson correlation coefficients (Zuur et al.

2010). Cook’s plot and boxplots were used to identify outliers and to investigate relationships between variables. PUFA, MUFA and !"#$!"#$ data showed homogeneity and normality of distribution. For survival we found no indication of zero-inflation or over-dispersion, and we decided to use GLM with a binomial distribution for the survival model. Once we had identified valid models we re-examined the residuals to ensure model assumptions were acceptable. Sample size is denoted n.

3.  Results  

3.1  Pb  content  in  mussels

 

We found a positive relationship between internal Pb concentration and Pb concentration in seawater. Mussel tissue Pb content increased with increasing Pb concentration of the seawater, except at the highest concentration (Fig. 1). The highest tissue concentration was found in mussels exposed to Pb concentrations of 4.50 mg/L with a mean tissue concentration of 3516 µg Pb/g dry weight (dw). Control mussels had an average Pb content of 39.9 µg Pb/g dw.

Referencer

RELATEREDE DOKUMENTER

During the 1970s, Danish mass media recurrently portrayed mass housing estates as signifiers of social problems in the otherwise increasingl affluent anish

However, based on a grouping of different approaches to research into management in the public sector we suggest an analytical framework consisting of four institutional logics,

In general terms, a better time resolution is obtained for higher fundamental frequencies of harmonic sound, which is in accordance both with the fact that the higher

In order to verify the production of viable larvae, small-scale facilities were built to test their viability and also to examine which conditions were optimal for larval

H2: Respondenter, der i høj grad har været udsat for følelsesmæssige krav, vold og trusler, vil i højere grad udvikle kynisme rettet mod borgerne.. De undersøgte sammenhænge

maripaludis Mic1c10, ToF-SIMS and EDS images indicated that in the column incubated coupon the corrosion layer does not contain carbon (Figs. 6B and 9 B) whereas the corrosion

In this study, a national culture that is at the informal end of the formal-informal continuum is presumed to also influence how staff will treat guests in the hospitality

If Internet technology is to become a counterpart to the VANS-based health- care data network, it is primarily neces- sary for it to be possible to pass on the structured EDI