Determination of adenosine triphosphate (ATP) and adenylate energy charge (AEC) in soil and use of adenine nucleotides as measures of soil microbial biomass and activity

Report no. S 1777

Determination of adenosine triphosphate (ATP) and adenylate energy charge (AEC) in soil

and use of adenine nucleotides as measures of soil microbial biomass and activity

Bestemmelse af adenosin trifosfat (ATP) og adenylat energiladning (AEC) i jord

og anvendelse af adenin nukleotider som mål

fo r mikroorganismernes biomasse og aktivitet i jorden

Finn Eiland

State Laboratory for Soil and Crop Research Soil Chemistry- and Biology Department DK-2800 Lyngby

Tidsskrift for Planteavls Specialserie

Copenhagen 1985

I §

i undervisningsministeriets bekendtgørel­

se af 31. januar 1977 ora erhvervelse af doktor­

graden er fastsat følgende bestemmelser vedrøren­

de det offentlige forsvar af doktorafhandlinger:

1

.. Forsvarshandlingen er offentlig og ledes af formanden for det kollegiale organ, som sagen ho­

rer under, eller en anden videnskabelig medarbej­

der eller lærer, som formanden har udpeget dertil.

2

. Til at fungere som officielle opponenter be­

skikkes to af bedømmelsesudvalgets medlemmer. Un­

der særlige omstændigheder kan dog andre fagkyn­

dige beskikkes som officielle opponenter.

i .

Eventuelle uofficielle opponenter må melde sig til den, der leder forsvarshandlingen, inden handlingens begyndelse. Lederen af foravarshand- lingen kan dog lade aenere anmeldte opponenter få ordet, men uden at fratage tidligere anmeldte op­

ponenter deres forrettigheder.

4

. Hvis doktoranden onsker det, kan der gives ham ret til at indlede forsvarshandlingen med en

forelæsning af Indtil l/2 times varighed, hvori dor gives en oversigt over afhrjidlingens emne og de forskningsresultater, der e.* fremlagt til be­

dømmelse. !

Der gives i almindelighed hver af de officiel­

le opponenter højst 1 l/2 time og hver uofficiel opponent højst 3/4 time, heri indbefattet den tid, doktoranden behøver til at give svar. Den tid, der gives opponenterne, kan dog efter omstændighederne indskrænkes eller udvides. Hele forsvarshandlingen må højst vare 6 timer.

6. F o rsvarshandlingen skal foregå på dansk, norsk eller ;'ven

k, medmindre der af det kollegiale or- 5an gives tilladelse til at anvende et andet sprog.

Den kgl. Veteri)nær- og Landbohøjskole.

D ^Statens Planteavlsforsøg

fMji(5 WJ l ^-

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\*' 1 ^ -

Report no. S 1777

Determination of adenosine triphosphate (ATP) and adenylate energy charge (AEC) in soil

and use of adenine nucleotides as measures of soil microbial biomass and activity

Bestemmelse af adenosin trifosfat (ATP) og adenylat energiladning (AEC) i jord

og anvendelse af adenin nukleotider som mål

for mikroorganismernes biomasse og aktivitet i jorden

Finn Eiland

State Laboratory for Soil and Crop Research Soil Chemistry- and Biology Department DK-2800 Lyngby

Forsvaret finder sted fredag den 10. januar 1986 kl. 14.00 i auditorium 1-01, Bülowsvej 13, Den kgl. Veterinær- og Landbohøjskole.

Tidsskrift for Planteavls Specialserie

Copenhagen 1985

Denne a f h a n d l i n g samt 10 t i l s l u t t e n d e a r b e j d e r e r a f Den k g l . V e t e r i n æ r - og Landbohøj skol es f ag r å d f o r gr undvi denskab a n t a g e t t i l o f f e n t ­ l i g t a t f o r s v a r e s f o r den j o r d b r u g s v i d e n s k a b e ­ l i g e d o k t o r g r a d .

København, den 22. o kt o be r 1985.

Uwe Kaufmann

Formand f o r f a g r å d e t f o r g r u ndvi denska b.

D E T E R M I N A T I O N O F A D E N O S I N E T R I P H O S P H A T E ( A T P ) A N D A D E N Y L A T E E N E R G Y C H A R G E ( A E C ) IN S O I L A N D U S E OF A D E N I N E N U C L E O T I D E S AS M E A S U R E S O F S O I L M I C R O B I A L

B I O M A S S A N D A C T I V I T Y

b y F I N N E I L A N D

C O N T E N T S

P a g e PREFACE... 6 A. I N T R O D U C T I O N ... 8

B. T H E F I R E F L Y B I O L U M I N E S C E N C E A S S A Y F O R M E A S U R I N G A T P

C O N T E N T ... 10 I n t r o d u c t i o n ... 10 S u r v e y o f d i f f e r e n t m e t h o d s u s e d f o r e x t r a c t i o n of

A T P f r o m s o i l ... 13 A m e t h o d f o r e x t r a c t i o n a n d m e a s u r e m e n t o f A T P f r o m s o i l a n d f r o m c u l t u r e s o f m i c r o o r g a n i s m s ... 2 0

M a t e r i a l s a n d m e t h o d s ( s e e A P P E N D I X I ) ... 1 60 D i s c u s s i o n o f t h e m e t h o d o l o g y ... 20

4

P a g e M e a s u r i n g b i o l u m i n e s c e n c e o f A T P ... 30 C r u d e or p u r i f i e d e n z y m e s ... 31 E f f e c t s o f i o n s a n d t e m p e r a t u r e o n t h e l u m i n e s c e n c e

r e a c t i o n ... 32 A T P c o n t e n t in s o i l ... 33

C. T H E R A T I O B E T W E E N T H E N U C L E O T I D E S _ATP, A D P A N D AMP

IN S O I L ... 35 I n t r o d u c t i o n ... 35 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s ( see A P P E N D I X I I ) ... 1 6 8 D i s c u s s i o n o f t h e m e t h o d o l o g y ... 37 A d e n i n e n u c l e o t i d e s a n d a d e n y l a t e e n e r g y c h a r g e

in s e l e c t e d s o i l s ... 40

D. E X T R A C T I O N O F A T P F R O M B A C T E R I A A N D F U N G I G R O W N IN

T H E P R E S E N C E O F B E N T O N I T E ... 49 I n t r o d u c t i o n ... ... 49 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s (see A P P E N D I X I I I ) ... 1 7 5 A T P c o n t e n t of a b a c t e r i u m a n d a f u n g u s ... 51 A T P c o n t e n t a n d n u m b e r of c e l l s in b a c t e r i a l c u l t u r e s a i r - d r i e d in p r e s e n c e a n d a b s e n c e of b e n t o n i t e ... 58

E. A T P C O N T E N T O F S O I L S A S I N F L U E N C E D B Y E N V I R O N M E N T A L

F A C T O R S ... '... 61 I n t r o d u c t i o n ... 61 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s (see A P P E N D I X I V ) ... 1 7 8 E f f e c t o f s o i l t e m p e r a t u r e o n A T P ... 62 E f f e c t o f t h e s o i l m o i s t u r e c o n t e n t o n A T P ... 72

P a g e E f f e c t o f a e r o b i c - a n a e r o b i c c o n d i t i o n s in s o i l

o n A T P ... 7 5 E f f e c t o f f r e e z i n g of s o i l s a m p l e s o n A T P ... 77

F. AT P C O N T E N T A S A M E A S U R E O F M I C R O B I A L A C T I V I T Y A N D

S I Z E O F B I O M A S S IN S O I L ... 80 I n t r o d u c t i o n ... 80 M a t e r i a l s a n d m e t h o d s (s ee A P P E N D I X V ) ... 183 C o r r e l a t i o n s b e t w e e n A T P c o n t e n t a n d m i c r o b i a l a c t i v i t y a n d b i o m a s s in f i e l d s o i l s ... 81 T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n A T P c o n t e n t a n d m i c r o b i a l

a c t i v i t y a n d b i o m a s s in s o i l ... 89 T h e A T P c o n t e n t in r e l a t i o n t o t h e a m o u n t s of

c a r b o n a n d m i n e r a l s in s o i l m i c r o o r g a n i s m s ... 98 S o m e e x a m p l e s t o i l l u s t r a t e t h e a p p l i c a t i o n of

t he A T P m e t h o d ... 100 M e t h o d s f o r d e t e r m i n a t i o n o f m i c r o b i a l a c t i v i t y

a n d b i o m a s s in s o i l ... 1 1 0

G. C O N C L U S I O N S A N D P E R S P E C T I V E S ... 115 A C K N O W L E D G E M E N T S ... 1 25 S U M M A R Y ... 126 D A N S K R E S U M E ( D A N I S H S U M M A R Y ) ... 1 36 R E F E R E N C E S ... 146 A P P E N D I X 1 ... 1 6 0 A P P E N D I X I I ... 1 68 A P P E N D I X I I I ... 1 75 A P P E N D I X I V ... 178 A P P E N D I X V ... 1 83

6

P R E F A C E

In t h i s t h e s i s a r e s u m m a r i z e d i n v e s t i g a t i o n s o n the a n a l y s e s of a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e (ATP) a n d a d e n y l a t e e n e r g y c h a r g e ( A E C ) in s o i l , t o g e t h e r w i t h w o r k d e a l i n g w i t h t h e u se of a d e n i n e n u c l e o t i d e s (ATP, A D P a n d A M P ) a s m e a s u r e s o f soil m i c r o b i a l b i o m a s s a n d a c t i v i t y . S o m e o f t h e r e s u l t s h a v e b e e n p u b l i s h e d in p a p e r s a s l i s t e d b e l o w . T h e p a p e r s a r e a r r a n g e d c h r o n o l o g i c a l l y a f t e r y e a r s o f p u b l i c a t i o n , a n d w i l l b e r e f e r r e d to b y R o m a n n u m e r a l s . O t h e r l i t e r a t u r e w i l l b e c i t e d b y n a m e of a u t h o r s a n d p u b l i s h i n g y e a r a n d l i s t e d u n d e r r e f e r e n c e s .

I« E i l a n d , F. ( 1 9 7 9 ) : A n i m p r o v e d m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n of a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e (ATP) in s o i l . S o i l B i o l . B i o c h e m . , 11, 3 1 - 3 5 .

H * E i l a n d , F. & N i e l s e n , B.S. ( 1 9 7 9 ) : I n f l u e n c e of c a t i o n c o n t e n t o n a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e d e t e r m i n a t i o n s in s o i l . M i c r o b i a l E c o l o g y , 5, 1 2 9 - 1 3 7 .

III. N i e l s e n , J . D . & E i l a n d , F. ( 1 9 8 0 ) : I n v e s t i g a t i o n s o n t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n P - f e r t i l i t y , p h o s p h a t a s e a c t i v i t y a n d A T P c o n t e n t in soi l . P l a n t a n d S o i l , 57, 9 5 - 1 0 3 .

IV. E i l a n d , F. ( 1 9 8 0 ) : T h e e f f e c t s o f m a n u r e a n d N P K f e r t i l i z e r s o n t h e s o i l m i c r o o r g a n i s m s i n a D a n i s h l o n g - t e r m f i e l d e x p e r i m e n t . D a n i s h J. P l a n t a n d S o i l S e i . , 84, 4 4 7 - 4 5 4 .

V I .

VII.

Vill.

IX.

E i l a n d , F. ( 1 9 8 1 ) : T h e e f f e c t s o f a p p l i c a t i o n o f s e w a g e s l u d g e o n m i c r o o r g a n i s m s in s o i l . D a n i s h J. P l a n t a n d S o i l S e i . 85, 3 9 - 4 6 .

E i l a n d , F. ( 1 9 8 1 ) : T h e e f f e c t s o f h i g h d o s e s o f s l u r r y a n d f a r m y a r d m a n u r e o n m i c r o o r g a n i s m s in s o i l . D a n i s h J. P l a n t a n d S o i l S e i . , 85, 1 4 5 - 1 5 2 .

E i l a n d , F. ( 1 9 8 1 ) : O r g a n i c m a n u r e in r e l a t i o n to m i c r o b i o l o g i c a l a c t i v i t y in s o i l . In A g r i c u l t u r a l Y i e l d P o t e n t i a l s in C o n t i n e n t a l C l i m a t e s . P r o c e e d i n g s o f t h e 1 6 t h C o l l o q u i u m of t h e I n t e r n a t i o n a l P o t a s h I n s t i t u t e h e l d in W a r s a w / P o l a n d . 1 4 7 - 1 5 6 .

S p a r l i n g , G. & E i l a n d , F. ( 1 9 8 3 ) : A c o m p a r i s o n of m e t h o d s f or m e a s u r i n g A T P a n d m i c r o b i a l b i o m a s s in s o i l s . S o i l B i o l . B i o c h e m . 15, 2 2 7 - 2 2 9 .

A n d e r s e n , C ., E i l a n d , F. & V i n t h e r , F . P. ( 1 9 8 3 ) : U n d e r ­ s ø g e l s e r a f l a n d b r u g s j o r d e n s ø k o l o g i m e d h e n b l i k p å j o r d b u n d e n s m i k r o f l o r a o g f a u n a i d y r k n i n s s y s t e m e r m e d v å r b y g , r e d u c e r e t j o r d b e h a n d l i n g o g e n e f t e r a f g r ø d e .

(In D a n i s h ; S u m m a r y in E n g l i s h ) T i d s s k r . P l a n t e a v l 87, 2 5 7 - 2 9 6 .

X. E i l a n d , F. ( 1 9 8 3 ) : A s i m p l e m e t h o d f o r q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f A T P in s o i l . S o i l B i o l . B i o c h e m . 15, 6 6 5 - 6 7 0 .

8

A. I N T R O D U C T I O N

M i c r o o r g a n i s m s a r e e s s e n t i a l in t h e c i r c u l a t i o n of n u t r i e n t s b e t w e e n t h e l i v i n g a n d n o n l i v i n g c o m p o n e n t s in t h e soil. In o r d e r to u n d e r s t a n d t h e s e p r o c e s s e s it is i m p o r t a n t to be a b l e to d e t e r m i n e t h e a m o u n t o f l i v i n g b i o m a s s a n d t h e a c t i v i t y o f t h e m i c r o o r g a n i s m s .

D u r i n g t h e l a s t d e c a d e m u c h e f f o r t h a s b e e n s p e n t o n t h e d e v e l o p m e n t o f n e w m e t h o d s in s o i l m i c r o b i o l o g y , w h i c h c o u l d r e p l a c e t h e c l a s s i c p r o c e d u r e s , e.g. t h e p l a t e c o u n t t e c h n i q u e a n d t h e d i r e c t m i c r o s c o p i c c o u n t ' t e c h n i q u e w i t h a l l t h e i r i n h e r e n t l i m i t a t i o n s . O n e o f t h e m o s t p r o m i s i n g a p p r o a c h e s in t h i s d i r e c t i o n b o t h f r o m a t h e o r e t i c a l a n d a p r a c t i c a l v i e w p o i n t is t h e A T P a n a l y s i s . It is s u i t a b l e a s a r o u t i n e p r o c e d u r e in e c o l o g i c a l s t u d i e s , w h i c h c a n b e c a r r i e d o u t o n a l a r g e n u m b e r of s a m p l e s w i t h i n a s h o r t t i m e .

T h e A T P a n a l y s i s h a s a l r e a d y b e e n u s e d t o a c o n s i d e r a b l e e x t e n t as a n e s t i m a t e o f m i c r o b i a l b i o m a s s or a c t i v i t y in a q u a t i c e c o s y ­ s t e m s ( B o w i e & G i l l e s p i e , 1 9 7 6 ; H o d s o n e t a l . , 1976; P a e r l &

W i l l i a m s , 1 9 7 6 ) a s w e l l a s in s o i l s ( M a c L e o d e t a l . , 196 9 ; L e e et a l . , 1 9 7 1 a ; A u s m u s , 1 9 7 3 ; P a u l & J o h n s o n , 1 9 7 7 ; J e n k i n s o n e t a l . , 1 9 7 9 ; O a d e s & J e n k i n s o n , 1 9 7 9 ; r e f s I, I I I , IV, V, V I & V I I ; A h m e d et a l . , 1 9 8 2 ; r e f s V i l l & IX ). B u t b e c a u s e of m e t h o d o l o g i c a l p r o b l e m s (e.g . A T P e x t r a c t i o n e f f i c i e n c y , i o n i c i n t e r f e r e n c e s , A T P a d s o r p t i o n o n t o s o i l p a r t i c l e s , u se o f c r u d e o r p u r i f i e d l u c i f e r i n - l u c i f e r a s e e n z y m e s a n d e f f e c t s of e n v i r o n ­ m e n t a l f a c t o r s o n A T P c o n t e n t in s o i l s a m p l e s ) , t h e m a i n p a r t of t h e a b o v e m e n t i o n e d p a p e r s h a v e d e a l t w i t h A T P m e t h o d s a n d o n l y a f e w s t u d i e s (e.g. r e f s IV, V, VI, V I I & IX) h a v e b e e n c a r r i e d o u t t o e l u c i d a t e s e a s o n a l c h a n g e s in m i c r o b i a l b i o m a s s or a c t i v i t y in t e r r e s t r i a l e c o s y s t e m s b y u s e of t h e A T P m e t h o d .

A T P c o n c e n t r a t i o n u s e d as a n e s t i m a t e o f l i v i n g b i o m a s s r e q u i r e s a f a i r l y c o n s t a n t r a t i o o f A T P t o b i o m a s s in d i f f e r e n t

s p e c i e s a n d d u r i n g d i f f e r e n t c o n d i t i o n s o f g r o w t h , w h i l e A T P c o n c e n t r a t i o n s u s e d a s a n e s t i m a t e o f t h e m i c r o b i a l a c t i v i t y r e q u i r e a c o r r e l a t i o n w i t h t h e g r o w t h r a t e . S o m e i n v e s t i g a t o r s h a v e f o u n d t h a t A T P c o n t e n t in b a c t e r i a is i n d e p e n d e n t o f t h e c e l l u l a r g r o w t h r a t e ( S m i t h & M a a l ø e , 1 9 6 4 ; F o r r e s t , 1 9 6 5 ; K n o w l e s & S m i t h , 1 9 7 0 ; H o b s o n & S u m m e r s , 1 9 7 2 ) , w h e r e a s o t h e r s h a v e i n d i c a t e d a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n A T P c o n t e n t a n d t h e g r o w t h r a t e ( N e i d h a r d t & F r a e n k e l , 1 9 6 1 ; B a g n a r a & F i n c h , 1 9 7 3 ) .

T he A T P c o n t e n t of a s o i l s a m p l e , p r o b a b l y w i l l r e f l e c t t h e a m o u n t of l i v i n g c y t o p l a s m a n d t h e s t a t e o f a c t i v i t y (t he a d e n y l a t e e n e r g y c h a r g e v a l u e ) o f t h e l i v i n g c e l l s p r e s e n t in t h e s o i l but t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e a n a l y t i c a l d a t a h a s b e e n d i f f i c u l t .

D e t e r m i n a t i o n o f a n a d e n y l a t e e n e r g y c h a r g e v a l u e b a s e d o n c e l l u l a r a d e n i n e n u c l e o t i d e c o n c e n t r a t i o n s (ATP, A D P a n d A M P ) is p r o p o s e d t o b e a m e a s u r e m e n t of t h e e n e r g e t i c s t a t e o f m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s iji v i v o . T h e r a t i o of t h e t h r e e m e n t i o n e d a d e n i n e n u c l e o t i d e s is d e p e n d i n g o n t h e m e t a b o l i c a c t i v i t y of t h e c e l l s . T h e r e f o r e , it s e e m s q u i t e r e a s o n a b l e t h a t t h e a c t i v i t y of t h e t o t a l m i c r o b i a l c o m m u n i t y in s o i l c o u l d b e d e t e r m i n e d m o r e e x a c t l y b y t h e a d e n y l a t e e n e r g y c h a r g e v a l u e r a t h e r t h a n b y A T P d e t e r m i n a t i o n s a l o n e .

In a d d i t i o n t o a d i s c u s s i o n o f t h e m e n t i o n e d s u b j e c t s t h e a i m o f the p r e s e n t s t u d y h a s b e e n : (1) T o w o r k o u t a s i m p l e m e t h o d f or q u a n t i t a t i v e e x t r a c t i o n a n d d e t e r m i n a t i o n of A T P in s o i l ; (2) t o d e v e l o p a m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f a d e n y l a t e e n e r g y c h a r g e (AEC) in s o i l ; (3) t o d e t e r m i n e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e a d e n i n e n u c l e o t i d e s a n d A E C in s o i l ; (4) to e x a m i n e d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s w h i c h m i g h t a f f e c t t h e A T P c o n t e n t in s o i l a n d (5) t o e x a m i n e t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n A T P c o n t e n t a n d o t h e r m e t h o d s w h i c h r e f l e c t e i t h e r m i c r o b i a l a c t i v i t y or m i c r o b i a l b i o m a s s in o r d e r t o e v a l u a t e t h e s u i t a b i l i t y o f A T P m e a s u r e m e n t s f o r d e t e c t i o n o f c h a n g e s in s o i l m i c r o b i a l b i o m a s s a n d a c t i v i t y in t e r r e s t r i a l e c o s y s t e m s .

10

B. T H E F I R E F L Y B I O L U M I N E S C E N C E A S S A Y F O R M E A S U R I N G A T P C O N T E N T

I n t r o d u c t i o n

It is g e n e r a l l y a g r e e d t h a t t h e r e is a n a s s o c i a t i o n b e t w e e n a d e n i n e 5 '- t r i p h o s p h a t e a n d l i v i n g c e l l s a n d t h e r e f o r e it c a n b e a u s e f u l i n d i c a t o r of l i f e ( H u e n n e k e n s & W h i t e l e y , 1 9 6 0 ) . A l l l i v i n g c e l l s c o n t a i n m o l e c u l e s , r e f e r r e d t o 'as n u c l e o t i d e s , w h i c h a r e e s s e n t i a l for v i a b i l i t y a n d g r o w t h . A d e n i n e - c o n t a i n i n g n u c l e o t i d e s , a d e n o s i n e 5 '- t r i p h o s p h a t e ( A T P ) , a d e n o s i n e 5 ' - d i p h o s p h a t e ( A D P ) , a n d a d e n o s i n e 5 1- m o n o p h o s p h a t e (AMP) h a v e s e v e r a l f u n c t i o n s . T h e y a r e t h u s r e s p o n s i b l e for c o u p l i n g i n t r a c e l l u l a r e n e r g y - p r o d u c i n g a n d e n e r g y - r e q u i r i n g m e t a b o l i c r e a c t i o n s , e . g . f or 1 ) s t o r a g e a n d t r a n s p o r t of c e l l u l a r m e t a b o l i c e n e r g y , 2) s y n t h e s i s o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d (DNA) a n d r i b o n u c l e i c a c i d (R N A ), 3) a c t i v a t i o n a n d t r a n s f e r of p r e c u r s o r s for c e l l u l a r b i o s y n t h e s i s , a n d 4) c o n t r o l a n d r e g u l a t i o n o f c e l l u l a r m e t a b o l i s m ( K ar l, 1 9 8 0 ) . S t u d i e s o n t h e r e g u l a t i o n o f e n z y m e f u n c t i o n a n d t h e c o n t r o l o f b i o s y n t h e t i c p r o c e s s e s h a v e r e s u l t e d in t h e a d e n y l a t e e n e r g y c h a r g e c o n c e p t (AEC) as d e f i n e d

I A T I ’I + '/i I A O P j

b y A t k i n s o n & W a l t o n ( 1 9 6 7 ): A I 2 C = - - - — - - - - — - - - -_{I A TI ’}] + [ADP| + | A M P | .

A E C p r o v i d e s a m e a s u r e o f t h e t o t a l a m o u n t o f m e t a b o l i c e n e r g y m o m e n t a r i l y s t o r e d in t h e a d e n i n e n u c l e o t i d e p o o l (see C h a p t e r C). F o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f A E C , A D P a n d A M P a r e e n z y m a t i c a l l y c o n v e r t e d to A T P a n d m e a s u r e d . T h e t u r n o v e r t i m e s f o r t h e i n t r a c e l l u l a r A T P p o o l in g r o w i n g b a c t e r i a h a v e b e e n f o u n d t o b e a s s h o r t a s 0 . 1 t o 1 . 0 s in g r o w i n g b a c t e r i a ( H a r r i s o n & M a i t r a , 1 9 6 9 ; H o l m s et a l . , 1 9 7 2 ; C h a p m a n & A t k i n s o n , 1 9 7 7 ) .

T he e m i s s i o n o f l i g h t c a t a l y s e d b y f i r e f l y l u c i f e r i n - l u c i f e r a s e fo r d e t e r m i n a t i o n o f a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( A T P ) , h a s b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y s i n c e t h e w o r k b y M c E l r o y ( 1 9 4 7 ) , w h i c h f i r s t r e c o g n i z e d t h a t l i g h t e m i s s i o n f r o m a f i r e f l y l a n t e r n e x t r a c t c o u l d be i n d u c e d b y t h e a d d i t i o n o f A T P a n d t h a t t h e d u r a t i o n of l i g h t e m i s s i o n w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t of A T P a d d e d .

T he l u c i f e r i n - l u c i f e r a s e s y s t e m h a d in m o s t c a s e s b e e n o b t a i n e d f r o m t h e f i r e f l y P h o t i n u s p y r a l i s , a l t h o u g h m a n y o t h e r l u m i n e s c e n t o r g a n i s m s a r e k n o w n .

L u c i f e r i n is a h e t e r o c y c l i c c o m p o u n d w h i c h is a c t i v a t e d b y a d e n y l a t i o n i n a n i n i t i a l r e a c t i o n s t e p (Fig. 1).

0 ( - ) L U C I F E R I N O X Y L U C I F E R I N

Fig. 1. S t r u c t u r e s of D ( - ) l u c i f e r in a n d o x y l u c i f e r i n .

( F r o m D e L u c a , 1 9 7 7 )

O x y l u c i f e r i n is p r o d u c e d b y o x i d a t i o n (Fig. 1). A n e x i t e d a n i o n i c f o r m of t h e o x y l u c i f e r i n m o l e c u l e is p r o b a b l y t h e l i g h t e m i t t o r

( W h i t e et a l . , 1 9 6 9 , 1 9 7 1 > .

Th e f i r e f l y e n z y m e l u c i f e r a s e c o n s i s t s o f t w o s u b u n i t s e a c h w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e l y 5 0 . 0 0 0 ( T r a v i s &

M c E l r o y , 1 9 6 6 ) . S u l f h y d r y l g r o u p s a r e e s s e n t i a l f or t h e c a t a l y t i c a c t i o n ( D e L u c a , 1 9 6 9 ) . T h e m e t h o d is b a s e d o n m e a s u r e m e n t o f t h e l i g h t e m i t t e d f r o m t h e i n t e r a c t i o n o f A T P w i t h l u c i f e r i n - l u c i f e r a s e a n d a t m o s p h e r i c o x y g e n . T h e r e a c t i o n r e q u i r e s a p H of a b o u t 7.5, t h e p r e s e n c e o f M g i o n s a n d a t e m p e r a t u r e of 20-25°C. T h e t o t a l l i g h t o u t p u t is d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l to t h e a m o u n t of A T P p r e s e n t , w h e n a l l t h e o t h e r c o m p o n e n t s o f t h e s y s t e m a r e in e x c e s s ( S e l i g e r & M c E l r o y , 1 9 5 9 ; S t r e h l e r , 1 9 6 8 ) .

12

T h e r e a c t i o n s i n v o l v e d a r e s i m p l i f i e d in F i g . 2 as f o l l o w s :

Mg 2 + r

ATP + luciferase + D (-)lu ciferin > [J u ciferase-lu ciferin - AM P - pH 7.75 complex^] + pyrophosphate

M g2 +

luciferase-luciferin - AMP + 0 2 > luciferase + oxyluciferin PH 7.75 + C 0 2 + AMP + light

Fig . 2. S c e m a t i c p r e s e n t a t i o n o f t h e f i r e f l y l u c i f e r i n - l u c i f e r a s e r e a c t i o n .

T h e f i r s t s t e p is t h e i n i t i a l a c t i v a t i o n r e s u l t i n g in f o r m a t i o n o f e n z y m e b o u n d l u c i f e r y l a d e n y l a t e f r o m r e d u c e d l u c i f e r i n , l u c i f e r a s e a n d A T P in t h e p r e s e n c e o f Mg ions. 2 + T h e l u c i f e r y l a d e n y l a t e r e m a i n s t i g h t l y b o u n d t o t h e l u c i f e r a s e a n d p y r o p h o s p h a t e is r e l e a s e d . In a s e c o n d step, t h e l u c i f e r y l a d e n y l a t e e n z y m e c o m p l e x is o x i d i z e d by m o l e c u l a r o x y g e n , r e s u l t i n g in C O 2 # A M P , l u c i f e r a s e a n d e l e c t r o n i c a l l y e x c i t e d o x y l u c i f e r i n . O n r e t u r n i n g t o t h e g r o u n d s t a t e t h e e x c i t e d c o m p l e x e m i t s l i g h t . T h e s t o i c h i o m e t r y is o n e D ( - ) l u c i f er in o x i d i z e d p e r A T P a n d 02 u t i l i z e d . T h e q u a n t u m y i e l d is v e r y h i g h , a b o u t 0 . 8 8 ( S e l i g e r & M c E l r o y , 1 9 6 0 ) . D e t a i l s o f t h e r e a c t i o n m e c h a n i s m a r e p r e s e n t e d in t h e r e v i e w by D e L u c a ( 1 9 7 6 ) . T h e n o r m a l l i g h t e m i s s i o n h a s a y e l l o w - g r e e n l i g h t w i t h a m a x i m u m a t 5 6 2 n m ( W h i t e et al., 1 9 7 1 ) . H o w e v e r , t e m p e r a t u r e , p H a n d c e r t a i n m e t a l i o n s c a n a f f e c t t h e c o l o u r , r e s u l t i n g i n a r e d l i g h t e m i s s i o n w i t h a m a x i m u m a b o u t 6 1 8 n m ( S e l i g e r &

M c E l r o y , 1 9 6 4 ).

T h e m e t h o d is v e r y s e n s i t i v e , 1 0- 1 4 m o l A T P c a n he m e a s u r e d u n d e r o p t i m u m c o n d i t i o n s ( K a r l & H o l m - H a n s e n , 1 9 7 6 ) .

S u r v e y o f d i f f e r e n t m e t h o d s u s e d f o r e x t r a c t i o n o f A T P f r o m s o i l

O r i g i n a l l y A T P e x t r a c t i o n m e t h o d s w e r e d e v e l o p e d f or e x t r a c t i n g A T P f r o m m i c r o b i a l c e l l s in p u r e c u l t u r e s . A r a n g e o f s u c h m e t h o d s a r e d i s c u s s e d b y L u n d i n & T h o r e ( 1 9 7 5 ) . T h e s e m e t h o d s a r e n o t e q u a l l y e f f e c t i v e in e x t r a c t i n g A T P f r o m s u c h a c o m p l e x m e d i u m as s o i l . A g o o d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e fo r s o i l s m u s t q u i c k l y i n a c t i v a t e t h e e n z y m e r e a c t i o n s in t h e s o i l s u s p e n s i o n , s o th at n e i t h e r s y n t h e s i s n o r d e g r a d a t i o n o f A T P c a n o c c u r . F u r t h e r m o r e , A T P p r e s e n t in a l l t h e m i c r o b i a l c e l l s s h o u l d be q u a n t i t a t i v e l y e x t r a c t e d , a n d t h e e x t r a c t s s h o u l d n o t c o n t a i n i o n s w h i c h s t r o n g l y d e p r e s s t h e l i g h t e m i s s i o n .

T h e e x t r a c t i o n o f A T P f r o m s o i l h a s b e e n f o u n d to p r e s e n t a n u m b e r of s p e c i a l p r o b l e m s , a r i s i n g f r o m ; 1) a d s o r p t i o n o f A T P m o l e c u l e s t o i n o r g a n i c a n d o r g a n i c p a r t i c l e s in s o i l , e . g . c l a y ( A n d e r s o n & D a v i e s , 1 9 7 3 ) , a l u m i n u m - a n d i r o n s e s q u i o x i d e s (ref.

II) a nd a c i d - s o l u b l e o r g a n i c c o m p o u n d s ( f u l v i c a c i d ) ( C u n n i n g h a m

& W e t z e l , 1 9 7 8 ) ; 2) i o n i c i n h i b i t i o n o f A T P l i g h t e m i s s i o n b y o r g a n i c a n d i n o r g a n i c m a t e r i a l in s o i l (ref. II) ; 3) p o o r e x t r a c t i o n e f f i c i e n c y o f A T P f r o m m i c r o o r g a n i s m s a s s o c i a t e d w i t h s o i l s u b s t a n c e s (ref. V i l l ) , a n d 4) c o - p r e c i p i t a t i o n o f A T P w i t h o t h e r s u b s t a n c e s u p o n n e u t r a l i z a t i o n of a c i d e x t r a c t s ( r e f s I &

II) .

N u m e r o u s m e t h o d s h a v e b e e n s u g g e s t e d d u r i n g t h e l a s t d e c a d e f o r e x t r a c t i o n o f A T P f r o m m i c r o b i a l c e l l s u s i n g m a n y d i f f e r e n t s o l v e n t s . H o w e v e r , n o n e o f t h e s e m e t h o d s f u l f i l t h e r e q u i r e m e n t s f o r a s i m p l e , r a p i d a n d q u a n t i t a t i v e e x t r a c t i o n u s i n g n o n - t o x i c r e a g e n t s , e x c e p t t h e m e t h o d s u g g e s t e d in ref. X.

S o i l A T P e x t r a c t i o n h a s b e e n p e r f o r m e d w i t h c o l d or b o i l i n g e x t r a c t a n t s h a v i n g a p H in t h e n e u t r a l r a n g e ( T a b l e 1). O t h e r s o i l A TP e x t r a c t i o n m e t h o d s a r e b a s e d o n c o l d a c i d e x t r a c t a n t s w i t h a pH b e l o w 2 ( T a b l e 1).

T a b l e 1. M e t h o d s a v a i l a b l e for e x t r a c t i o n of A T P f r o m s o i l

M e n s t r u u m R e f e r e n c e s

C o l d e x t r a c t a n t s w i t h a pH in the n e u t r a l r a n g e : B i c a r b o n a t e - c h l o r o f o r m ( N a H C O ^ - C H C l ^ )

N - b u t a n o l - o c t a n o l

NR E $ ^ ( L u m a c ) n u c 1 e o t i d e - r e 1 ea s i ng a g e n t

N - b r o m o s u c c i n i m i d e - E D T A - a r e s e n a t e

B o i l i n g e x t r a c t a n t s w i t h a pH in the n e u t r a l r a n g e : B i c a r b o n a t e ( N a H C O ^ )

[ T r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ] - E t h y 1 e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d b u f f e r

( T r i s - E D T A b u f f e r )

P a u l & J o h n s o n , 1 9 7 7 C o n k l i n & M a c g r e g o r , 19 7 2 V a n de W e r f & V e r s t r a e t e , 1 9 7 9 N i e l s e n & E i l a n d , ref. Ill V e r s t r a e t e et a l ., 1 9 8 3 M a c L e o d et al., 1 9 6 9

C h r i s t i a n et al., 1 9 7 5 P a u l & J o h n s o n , 1 97 7

H a m i l t o n & H o l m - H a n s e n , 1 9 6 7 L e e et al ., 1 9 7 1 a

C o n k l i n & M a c g r e g o r , 19 7 2 A u s m u s , 197 3

K a r l & L a R o c k , 1 9 7 5 K a c z m a r e k et al ., 1 9 7 6 E i l a n d , ref. I

F o r m i c a c i d ( H C O O H ) P e r c h l o r i c a c i d ( H C I O ^ )

S u l p h u r i c a c i d ( t ^ S O ^ )

S u l p h u r i c a c i d - p h o s p h a t e a n d NR ( H 2 S 0 4 - P 0 4 a n d N R B ^ M

T r i c h l o r a c e t i c a c i d (TCA)

T r i c h l o r a c e t i c a c i d - p h o s p h a t e - p a r a q u a t ( T C A - P O ^ - p a r a q u a t )

E i l a n d , ref. I K l o f a t et a l ., 1 9 6 9 A u s m u s , 1 9 7 3

E i l a n d , ref. I L e e et al . , 1 9 7 1 a A u s m u s , 1 9 7 3 E i l a n d , ref. I E i l a n d , ref. X

B a g n a r a & F i n c h , 1 9 7 2 E i l a n d , ref. I

J e n k i n s o n & O a d e s , 1 9 7 9

16

T h e c o l d e x t r a c t a n t s w i t h a p H in t h e n e u t r a l r a n g e d o n o t a l w a y s e f f e c t i v e l y s t o p t h e e n z y m e a c t i v i t y , w h i c h m a y r e s u l t in h y d r o l y s i s o f A T P d u r i n g t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e . F o r e x t r a c t i o n o f A T P f r o m s o i l , P a u l & J o h n s o n ( 1 9 7 7 ) u s e d c o l d b i c a r b o n a t e to f l o o d t h e s o i l c o l l o i d a l s y s t e m w i t h a n i o n t h a t i n t e r f e r e s w i t h t h e a d s o r p t i o n o f A T P t o s o i l p a r t i c l e s a n d c h l o r o f o r m to l y s e t h e c e l l s . J e n k i n s o n et al. (19 79) c o m p a r e d t h i s m e t h o d w i t h a t r i c h l o r a c e t i c a c i d - p h o s p h a t e - p a r a q u a t e x t r a c t i o n ( J e n k i n s o n &

O a d e s , 1 9 7 9 ) a n d f o u n d t h a t t h e l a t t e r m e t h o d e x t r a c t e d t h e h i g h e s t a m o u n t o f A T P , a l t h o u g h t h e h i g h e s t r e c o v e r y o f A T P w a s o b t a i n e d b y t h e N a H C O3- C H C l3 m e t h o d .

C o n k l i n & M a c g r e g o r ( 1 9 7 2 ) c o m p a r e d a n - b u t a n o l - o c t a n o l r e a g e n t w i t h f o r m i c a c i d ( K l o f a t et a l . , 1 9 6 9 ) , h o t T r i s ( H a m i l t o n &

H o l m - H a n s e n , 1 9 6 7 ) a n d n - b r o m o s u c c i n i m i d e - E D T A - a r s e n a t e ( M a c L e o d et a l . , 1 9 6 9 ) . T h e y f o u n d t h a t n - b u t a n o l - o c t a n o l w a s m o s t e f f e c t i v e in e x t r a c t i o n o f A T P f r o m s o i l .

A n u c l e o t i d e r e l e a s i n g r e a g e n t (,NRE^) h a s b e e n u s e d (Van de W e r f & V e r s t r a e t e , 1 9 7 9 ; r ef. Ill; V e r s t r a e t e e t al., 1 9 8 3 ) . T h e e x t r a c t i o n o f A T P f r o m s o i l w i t h t h e N R B r e a g e n t w a s p e r f o r m e d b y E i l a n d in a f e w s t u d i e s (ref. Ill ), b e c a u s e o f its s i m p l i c i t y a n d b e c a u s e it h a d b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e r e a g e n t o n l y e x t r a c t e d A T P f r o m m i c r o b i a l c e l l s ( L u m a c C o m p a n y ) . T h e m e t h o d w a s b a s e d o n a " d i r e c t " e x t r a c t i o n p e r f o r m e d u n d e r n e a r l y n e u t r a l c o n d i t i o n s a t 0°C ( p a g e 1 6 7 , A P P E N D I X I). H o w e v e r , o n l y a m i n o r p a r t o f t h e A T P c o n t e n t p r e s e n t in t h e s o i l w a s e x t r a c t e d (r e f . V i l l ) . It w a s a l s o f o u n d t h a t c l a y a n d s o i l w a t e r c o n t e n t s t r o n g l y i n f l u e n c e d t h e e x t r a c t e d a m o u n t o f A T P w i t h t h i s m e t h o d ( T a b l e 5).

M o s t a u t h o r s w h i c h h a v e c o m p a r e d d i f f e r e n t A T P e x t r a c t a n t s f o u n d t h a t b o i l i n g T r i s - E D T A b u f f e r h a d a p o o r e f f i c i e n c y a s c o m p a r e d t o a c i d e x t r a c t a n t s (Lee e t a l . , 1 9 7 1 a ; C o n k l i n &

M a c g r e g o r , 1 9 7 2 ; A u s m u s , 1 9 7 3 ; K a r l & L a R o c k , 1 9 7 5 ; ref. I). T h e e x c e p t i o n w a s t h e s t u d y b y K a c z m a r e k e t al. ( 1 9 7 6 ) ; t h e y p r e f e r r e d b o i l i n g T r i s .

A l t h o u g h b o i l i n g o f t h e s o i l e x t r a c t s s h o u l d h a v e t h e a d v a n t a g e o f s t o p p i n g t h e e n z y m e a c t i v i t y , a l o s s o f A T P in s o i l d u r i n g t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e w i t h T r i s b u f f e r (pH 7 . 5 ) h a s b e e n o b s e r v e d (ref. I). W h e n e x t r a c t i n g A T P f r o m a m a t e r i a l w i t h a h i g h h e a t c a p a c i t y , t h e t e m p e r a t u r e of t h e b u f f e r e x t r a c t a n t d r o p s t o t h a t o f t h e a d d e d m a t e r i a l (e.g. s o i l ) w i t h a c o n s e q u e n t l o s s in e x t r a c t e d A T P ( H o l m - H a n s e n & B o o t h , 1 9 6 6 ) . K a r l & L a R o c k ( 1 9 7 5 ) f o u n d t h a t u s e o f c o i l i n g ' T r i s to e x t r a c t A T P f r o m b e a c h s a n d s a n d s e d i m e n t s y i e l d e d e x t r e m e l y v a r i a b l e r e s u l t s . T h e y s u g g e s t e d t h a t the v a r i a b i l i t y m a y b e d u e t o e f f e c t s o f t h e r m a l g r a d i e n t s e s t a b l i s h e d in a f l u i d - s o l i d m i x t u r e . W h e n s o l i d s a r e s u b m e r s e d in l i q u i d s , a t r a n s i t i o n or b o u n d a r y l a y e r o f f l u i d is e s t a b l i s h e d a r o u n d t h e s o l i d t h a t d o e s n o t h a v e t h e t h e r m a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e b u l k f l u i d . W h e n t h e f l u i d is h e a t e d , a s h a r p t h e r m a l g r a d i e n t is e s t a b l i s h e d a c r o s s t h e b o u n d a r y l a y e r . B a c t e r i a a d h e r i n g t o t h e s o l i d f a l l w i t h i n t h i s t h e r m a l g r a d i e n t a c r o s s t h e b o u n d a r y l a y e r , a n d t h u s t h e t e m p e r a t u r e s t o w h i c h t h e y are e x p o s e d m a y n o t b e h i g h e n o u g h to e f f i c i e n t l y e x t r a c t A T P a nd p r e v e n t i t s h y d r o l y s i s .

M o s t c o m p a r i s o n s of d i f f e r e n t e x t r a c t a n t s h a v e s h o w n t h a t c o l d a c i d i c r e a g e n t s w i t h a p H b e l o w 2 is to be p r e f e r r e d t o e x t r a c t A T P f r o m s o i l ( L e e e t a l . , 1 9 7 1 a ; A u s m u s , 1 9 7 3 ; ref. I; J e n k i n s o n

& O a d e s , 1 9 7 9 ; ref. X). T h e s e a u t h o r s f o u n d t h a t t h e b e s t e x t r a c t a n t o f t h o s e t e s t e d w a s e i t h e r s u l p h u r i c a c i d or t r i c h l o r a c e t i c a c i d ( T C A ) . A p H b e l o w 2 w a s i m p o r t a n t t o e n s u r e t h a t the p h o s p h a t e g r o u p s o f t h e A T P m o l e c u l e s w e r e u n d i s s o c i a t e d . - T h e a c i d k i l l s t h e c e l l s , r e l e a s e s i n t a c t A T P a n d i n a c t i v a t e s t h e A T P h y d r o l y s i n g e n z y m e s . D u r i n g t h e e x t r a c t i o n t h e m o s t r e a c t i v e P - r e t a i n i n g c o m p o n e n t s s u c h as t h e a m o r p h o u s F e - a n d A l - s e s q u i o x i d e s a n d C a C O3 t e n d t o b e d i s s o l v e d t h u s r e l e a s i n g m o r e o f t h e A T P t h a n u n d e r n e u t r a l c o n d i t i o n s ( L e e et a l . , 19 7 1 a ) .

TCA, s u l p h u r i c a c i d , D M S O - a c i d a n d p e r c h l o r i c a c i d e x t r a c t e d

2

18

A T P e f f i c i e n t l y f r o m s o i l s (ref. I). H o w e v e r p e r c h l o r i c a c i d p r o v e d u n s u i t a b l e ; t h i s w a s e i t h e r c a u s e d b y the s t r o n g i n h i b i t o r y e f f e c t o n t h e l u m i n e s c e n c e r e a c t i o n b y t h e n e u t r a l i z e d e x t r a c t (ref. I) o r b y c o n s i d e r a b l e l o s s o f A T P b y c o ­ p r e c i p i t a t i o n w i t h p e r c h l o r i c a c i d ( W i e n e r et al., 1 9 7 4 ) . S u l p h u r i c a c i d a n d T C A w e r e f o u n d to b e m o s t s u i t a b l e for s o i l A T P e x t r a c t i o n s (ref. I). T o a v o i d a c o - p r e c i p i t a t i o n of A T P w i t h e . g . Fe, A l, or C a in t h e a c i d s o i l e x t r a c t s o n a d j u s t m e n t t o p H 7 . 5 , a d i l u t i o n is n e c e s s a r y (ref. II ). T h e i o n s c a n a l s o b e r e m o v e d b y c a t i o n e x c h a n g e b e f o r e p H - a d j u s t m e n t . T h e m e t h o d f o u n d t o b e m o s t e f f i c i e n t a m o n g d i f f e r e n t e x t r a c t a n t m e t h o d s t e s t e d , w a s b a s e d o n s u l p h u r i c a c i d e x t r a c t i o n , f o l l o w e d b y f i l t r a t i o n , c a t i o n e x c h a n g e c l e a n - u p o n N a + r e s i n , ' a n d p H a d j u s t m e n t w i t h e t h a n o l a m i n e (ref. I). H o w e v e r , it w a s d i f f i c u l t to o b t a i n q u a n t i t a t i v e v a l u e s in a l l s o i l t y p e s b y t h e m e n t i o n e d s u l p h u r i c a c i d A T P m e t h o d (ref. V i l l ) , T h i s w a s p r o b a b l y c a u s e d b y a c o m b i n e d e f f e c t of a n e x t r a c t a n t to s o i l r a t i o ( m l / g we t w e i g h t s o i l ) o f 1 .2 :1 . 0 a n d u s e o f s u l p h u r i c a c i d w i t h o u t p h o s p h a t e a n d T h e u s e d r a t i o w a s .o r i g i n a l l y c h o s e n t o o b t a i n e n o u g h s e n s i t i v i t y f o r m e a s u r i n g A T P w i t h t h e e q u i p m e n t e a r l i e r u s e d . U s i n g m o r e s e n s i t i v e e q u i p m e n t f o r m e a s u r i n g A T P it w a s f o u n d t h a t m o r e A T P c o u l d b e e x t r a c t e d b y i n c r e a s i n g t h e e x t r a c t a n t to s o i l r a t i o a n d f i l t r a t i o n a n d c a t i o n - e x c h a n g e c o u l d be a v o i d e d (ref. X). T h e s u g g e s t e d A T P m e t h o d is d i s c u s s e d in a s e p a r a t e s e c t i o n ( p a g e 20; s e e a l s o A P P E N D I X I, p a g e 1 6 0 ) .

T o a v o i d a d s o r p t i o n o n t o t h e s o i l c o l l o i d s o f r e l e a s e d A T P f r o m t h e m i c r o o r g a n i s m s , c o m p o u n d s c a n b e i n c l u d e d i n the e x t r a c t a n t w h i c h a r e k n o w n to b e a d s o r b e d o n t h e s o i l c o l l o i d s , r e s u l t i n g in a d e s o r p t i o n o f A T P . B o t h A T P a n d p h o s p h a t e molecule's c a n b e b o u n d o n p o s i t i v e l y c h a r g e d s i t e s in s o i l a n d t h u s c o m p e t e f or t h e a d s o r p t i o n o n t h e s o i l c o l l o i d s .

J e n k i n s o n & O a d e s ( 1 9 7 9 ) u s e d a n a d d i t i o n o f b o t h p h o s p h a t e a n d p a r a q u a t d i c h l o r i d e to a t r i c h l o r a c e t i c a c i d ( T C A ) e x t r a c t a n t . In a r e d b r o w n l o a m s o i l u n d e r p e r m a n e n t p a s t u r e , t h e y f o u n d t h a t

a d d i t i o n o f p h o s p h a t e i n c r e a s e d t h e q u a n t i t y o f s o i l - A T P e x t r a c t e d f r o m 0 . 1 6 to 0 . 6 4 ug A T P / g d . w t . s o i l , a n d t h e a m o u n t e x t r a c t e d w a s f u r t h e r i n c r e a s e d to 1 . 1 0 pg A T P / g d . w t . b y a d d i t i o n of p a r a q u a t . T h e m e t h o d is v e r y e f f e c t i v e f or e x t r a c t i n g A T P f r o m s o i l m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s b u t b o t h T C A a n d p a r a q u a t a r e t o x i c r e a g e n t s . F u r t h e r m o r e , t h e p r o c e d u r e f o r r e c r y s t a l l i z i n g t h e t e c h n i c a l g r a d e p a r a q u a t d i c h l o r i d e is t i m e c o n s u m i n g , a n d t h e p u r e c h e m i c a l ( m e t h y l v i o l o g e n , S i g m a ) is v e r y e x p e n s i v e .

V e r s t r a e t e e t al. ( 1 9 8 3 ) i n c l u d e d 0 . 1 M p y r i d i n e a n d 0 . 1 M d e c a n e ,1 ,1 0- b i s t r i m e t h y l a m m o n i u m i o d i d e in c a s e o f v e r y h e a v y t e x t u r e d s o i l s ( > 2 5 % c l a y ) w i t h p o t e n t i a l A T P s o r p t i o n p r o b l e m s . T h i s c o m p o u n d w a s c h o s e n i n s t e a d o f p a r a q u a t d i c h l o r i d e . E i l a n d (ref. X) d i d n o t f i n d a n i n c r e a s e d A T P c o n t e n t b y i n c l u d i n g p a r a q u a t d i c h l o r i d e in t h e s u l p h u r i c a c i d - p h o s p h a t e - N R B p r o c e d u r e f o r e x t r a c t i o n f r o m a s o i l c o n t a i n i n g 1 1 . 9 % c l a y . a c t s in a s i m i l a r m a n n e r to p a r a q u a t d i c h l o r i d e a n d p y r i d i n e t o g e t h e r w i t h d e c a n e ,1 ,1 0- b i s t r i m e t h y l a m m o n i u m i o d i d e , b e c a u s e it c a n b e b o u n d t o c l a y a n d o t h e r s o i l c o l l o i d s .

20

A me t h o d f o r e x t r a c t i o n a n d m e a s u r e m e n t o f A T P f r o m s o i l a n d f r o m c u l t u r e s o f m i c r o o r g a n i s m s

M a t e r i a l s a n d m e t h o d s ( s e e A P P E N D I X I )

D i s c u s s i o n o f t h e m e t h o d o l o g y

T h e e x p e r i e n c e f r o m t h e e a r l i e r u s e d m e t h o d s ( r e f s I & III) a n d t h e i n t r o d u c t i o n of m o r e s e n s i t i v e A T P p h o t o m u l t i p l y e r s h a v e r e s u l t e d in a d e v e l o p m e n t of a n e w i m p r o v e d p r o c e d u r e fo r e x t r a c t i o n o f A T P f r o m s o i l . It h a s g r e a t a d v a n t a g e s , c o m p a r e d w i t h m o s t o t h e r t e c h n i q u e s a v a i l a b l e f o r A T P e x t r a c t i o n f r o m s o i l s a m p l e s . T h e m e t h o d is s i m p l e , r a p i d a n d g i v e s r e p r o d u c i b l e r e s u l t s . A f t e r c o r r e c t i o n f or r e c o v e r y of a d d e d A T P ( i n t e r n a l s t a n d a r d s ) , t h e r e s u l t s p r o b a b l y r e p r e s e n t i n g t he t o t a l a m o u n t o f A T P in s o i l . U s e of i n t e r n a l s t a n d a r d s c o r r e c t s f o r : 1) D e g r a d a t i o n a n d a d s o r p t i o n of A T P d u r i n g t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e , a n d 2 ) i n h i b i t i o n of t h e l u m i n e s c e n c e r e a c t i o n b y i o n s

a n d o t h e r c o m p o n e n t s in t h e s o i l e x t r a c t s a n d t h e e x t r a c t a n t s o l u t i o n u s e d . In a d d i t i o n no t o x i c r e a g e n t s w e r e u s e d (ref. X).

S o m e c h a r a c t e r i s t i c s of t h e s o i l s u s e d to e x a m i n e t h e p r o p o s e d A T P m e t h o d a r e g i v e n in T a b l e 2.

T o c o m p e t e w i t h A T P m o l e c u l e s f or a d s o r p t i o n o n t h e s o i l c o l l o i d s , p h o s p h a t e w a s a d d e d t o t h e s u l p h u r i c a c i d e x t r a c t a n t a n d a q u a t e r n a r y a m m o n i u m c o m p o u n d (NR^§^) w a s a l s o u s e d in t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e f o r t h e s a m e p u r p o s e .

In p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , p a r a q u a t w a s a d d e d t o d i f f e r e n t e x t r a c t a n t s u s e d f o r A T P e x t r a c t i o n f r o m a s i l t l o a m s o i l ( T a b l e 3). A d d i t i o n o f p a r a q u a t to a s u l p h u r i c a c i d - p h o s p h a t e e x t r a c t a n t d i d n o t i n c r e a s e A T P e x t r a c t i o n , w h e n t h e N R B r e a g e n t w a s used. P a r a q u a t d i c h l o r i d e s l i g h t l y d e p r e s s e d t h e l i g h t e m i s s i o n in a l l e x t r a c t a n t s . U s e of N R B r e a g e n t in t h e s u g g e s t e d p r o c e d u r e i n c r e a s e d t h e l i g h t e m i s s i o n a n d c a u s e d a d e c a y i n g l i g h t s i g n a l a f t e r 3 0 - 4 0 s f o r a l l t h e e x t r a c t a n t s . A v e r y s l o w d e c a y of t h e l i g h t s i g n a l w a s o b s e r v e d f o r a l l e x t r a c t s w i t h o u t u s e of N R i @ i n t h e p r o c e d u r e . B e c a u s e o f t h e f a s t d e c l i n e o f t h e l i g h t e m i s s i o n w i t h u s e o f N R ^ S ) t h e s u g g e s t e d m e t h o d i n c l u d i n g N R c a n n o t b e u s e d in l i q u i d s c i n t i l l a t i o n s p e c t r o m e t e r s in w h i c h ATP is m e a s u r e d o v e r p e r i o d s e x e e d i n g 1 m i n a f t e r m i x i n g of t h e s o i l e x t r a c t w i t h t h e e n z y m e . A s f a r a s is k n o w n t h e m e c h a n i s m w h i c h c a u s e d t h e d e c l i n e h a s n o t b e e n e x a m i n e d . It c o u l d be d u e t o a c a t a l y t i c e f f e c t o f t h e N R B r e a g e n t .

n r^ÉD e n h a n c e d t h e s e n s i t i v i t y o f t h e m e a s u r e m e n t b y g i v i n g h i g h e r c o u n t s a n d a l s o i n c r e a s e d t h e e x t r a c t i o n o f A T P f r o m s o i l i n t h e s u g g e s t e d m e t h o d d u e t o t h e a d s o r p t i o n of N R E ^ t o t h e s o i l c o l l o i d s (Tab-le 3), a n d t h u s c o m p e t i n g w i t h t h e A T P m o l e c u l e s .

T a b l e 2. S o m e c h a r a c t e r i s t i c s of the s o i l s u s e d (ref. X)

M o i s t u r e C l a y Silt F i n e s a n d C o a r s e s a n d C E C O r g a n i c To tal P. K .

l

Soi l pH c o n t e n t * < 0 . 0 0 2 mm 0 . 0 0 2 - 0 .02 m m 0 . 0 2 - 0 . 2 mm 0 . 2 - 2 .0 mm (m .e q u i v ./ C N (yg P/ <yg K/

( L o c a t i o n ) (C a C l 2 ) ( %) ( %) ( %) (!£) (S) 100 g d . w t.

so i l ) (S) (%) g d W t.

s o i l ) g 1 d . w t.

s o i l ) C o a r s e s a n d y s o i l 1

( J y n d e v a d , D e n m a r k ) I 5.2

I ND

10. G 10. 5

3.9 4 . 1 1 2 . 2 7 6 . 8 9 . 3 1 . 7

1.7 0 . 1 1 0. 10

180 183

189 80 F i n e s a n d y s o i l I

( T y l s t r u p , D e n m a r k ) I 5.4

I ND

19. 7 32 . 1

3.7 6.2 7 5 . 8 12. 0 8 . a 1 .6

1 . 5 0 . 1 3 0 . 1 1

363 318

355 186 S a n d y l o a m s o i l I

( R o s k i l d e , D e n m a r k ) I 6.8

I ND

22 .7 15. 5

10. 1 22 .8 57 . 7 6. 8 1 4 . 4 1.8

1 . 7 0 . 1 7 0 . 1 7

216

22 5 178

94

L o a m s o i l I

( R ø n h a v e , D e n m a r k ) I 6. 9

I ND

2 2 . 2 1 3 . 6

1 6.3 2 1. 1 36. 7 2 4 . 0 13 .4 1. 6

1.4 0 . 1 5

0 . 1 5 243 267

221 224 S i l t y l o a m s o i l I

( H ø j e r , D e n m a r k ) I 6 .9

I ND

2 6 . 7 33. 8

11 .9 13. 2 72 . 5 0. 6 13 .1 1 .9

2 . 1

0. 19 0 . 1 8

21 6 237

147 248

H u m u s s o i l I

(S w e d e n )

II 3.2 1 9 3 . 7 ND ND ND ND ND 4 0 . 0 0 0 . 5 5 1 . 0 x l 0 3 6 . 2 x l 0 3

♦D e t e r m i n e d p r i o r to a n a l y s i s .

R e s u l t s a r e m e a n s of d u p l i c a t e s a m p l e s . NO = No d e t e r m i n a t i o n .

I. A g r o u p of s o i l s T r o m p l o u g h e d p l o t s , s a m p l e d in S e p t e m b e r 19 81, a n d s t o r e d at 5°C for 90 d a y s , a n d t h e n at 25°C for 5 da y s . II. A g r o u p of s o i l s f r o m r o t a v a t e d p l o t s , s a m p l e d in M a y 1981, a n d s t o r e d at 5°C for 2 1 0 da ys.

III. The h u m u s s o i l f r o m a F o r e s t w a s s a m p l e d in S e p t e m b e r 1981, a n d s t o r e d at 5°C for 90 d a y s , a n d t h e n at 2 5°C for 5 d a y s . I, II. A r a b l e s o i l s s a m p l e d f r o m the 0 - 5 cm l a y e r , and c a r r y c o n t i n u o u s b a r l e y , w i t h a m u s t a r d c a t c h c r o p . O n l y i n o r g a n i c f e r t i l i z e r s h a v e b e e n a p p l i e d . So il t e x t u r e w a s q u o t e d f r o m H a n s e n ( 1 9 7 6 J .

T a b l e 3. C o m p a r i s o n of A T P e x t r a c t i o n e f f i c i e n c y f r o m s o i l by d i f f e r e n t e x t r a c t a n t s (ref. X)

S i l t l o a m s o i l ( H ø j e r )

E x t r a c t e d ATP E x t r a c t e d A T P E x t r a c t e d ATP w i t h N R B 1) w i t h o u t N R B 1) w i t h N R B / w i t h o u t E x t r a c t a n t l i g h t u n i t s / 3 0 s l i g h t u n i t s / 3 0 s NRB

r a t i o

H 2 S V P D 4 5 5 5 4 2 2 5 5 3 9 2 . 1 7

A T P s t a n d a r d in

h2s o4 -p°4 4 7 5 6 2 2 6 2 1 4 1.81

H ^ S O ^ - P O ^ - p a r a q u a t 4 6 0 1 4 2 1 9 5 4 2 . 1 0

A T P s t a n d a r d in

b ^ S O ^ - P O ^ - p a r a q u a t 4 1 4 9 0 2 2 4 2 8 1 . 8 5

T C A - P 0 .2 ) 4 4 3 0 9 2 2 1 9 9 0 1 . 96

A T P s t a n d a r d in

T C A 2 ) -P0,4 4 6 4 7 0 2 5 5 4 8 1 . 8 2

T C A - P O ^ - p a r a q u a t2 ) 4 0 9 5 6 2 0 9 7 3 1 . 9 5

A T P s t a n d a r d in

T C A ^ - P O ^ - p a r a q u a t 4 0 3 9 8 2 1 7 6 2 1 . 8 6

A T P s t a n d a r d in

T r i s - E D T A b u f f e r 5 5 2 5 6 3 1 6 0 4 1 . 7 5

R e s u l t s are m e a n s o f t r i p l i c a t e s a m p l e s .

A l l ATP m e a s u r e m e n t s in the d i f f e r e n t e x t r a c t w e r e m a d e by the p r o p o s e d p r o c e d u r e . C o n t r o l A TP s t a n d a r d s w e r e m a d e in the e x t r a c t a n t s o l u t i o n s a n d in T r i s - E D T A b u f f e r , r e s p e c t i v e l y . S t a n d a r d s w e r e a d d e d to the e x t r a c t a n t s w i t h o u t so i l .

1) n r$^L A q u a t e r n a r y a m m o n i u m d e t e r g e n t ( L u m a c ) 2) TCA = t r i c h l o r a c e t i c acid.

24

T h e e f f e c t s o f s h a k i n g a n d u l t r a s o n i f i c a t i o n o n e x t r a c t i o n o f A T P w e r e e x a m i n e d o n a s a n d y l o a m s o i l ( T a b l e 4). E x t r a c t i o n of A T P i n c r e a s e d w i t h d u r a t i o n o f s h a k i n g , g i v i n g 1.39 u g / g d . w t . s o i l a f t e r 15 m i n s h a k i n g ( c o r r e c t e d f or r e c o v e r y of a d d e d A T P b y i n t e r n a l s t a n d a r d s ) . T h e s h a k i n g t i m e in t h i s e x p e r i m e n t w a s n o t c o n t i n u e d u n t i l a c o n s t a n t A T P c o n t e n t w a s o b t a i n e d . T h i s h a s b e e n d o n e in a n e x p e r i m e n t u s i n g t h e s a m e s o i l t y p e a n d t h e s a m e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e f o u n d a f t e r 15 a n d 2 0 m i n s h a k i n g t i m e , w h e r e a s 25 a n d 3 0 m i n s h a k i n g time r e s u l t e d

in 1 0 % d e c r e a s e in t h e A T P c o n t e n t . S h a k i n g i n c r e a s e d t h e t e m p e r a t u r e o f t h e s o i l s u s p e n s i o n f r o m 0°C t o 3°C i r r e s p e c t i v e

o f t h e t i m e o f s h a k i n g . U l t r a s o n i f i c a t i o n "(MSE 150 W u l t r a s o n i c d i s i n t e g r a t o r w i t h a 8 m m p r o b e tip) f o r 1 m i n w i t h f u l l p o w e r g a v e a f t e r c o r r e c t i o n f or r e c o v e r y 1 . 3 3 ug A T P / g d .w t . s o i l , w i t h 8 6 % r e c o v e r y o f a d d e d A T P , a n d a n i n c r e a s e in t e m p e r a t u r e f r o m 0°C t o 16°C. W h e n t h e s o i l w a s u l t r a s o n i f i e d for 3 m i n , t h e a d d e d A T P w a s r e c o v e r e d w i t h 73 %, w h e r e a s t h e q u a n t i t y o f A T P e x t r a c t e d w a s n e a r l y t h e s a m e a s w h e n u l t r a s o n i f i e d for 1 min- or s h a k e n f o r 15 m i n . U l t r a s o n i f i c a t i o n f o r 3 m i n i n d i c a t e d a l o s s o f t h e a d d e d A T P s t a n d a r d s o l u t i o n , w h i c h r e s u l t e d in m i s l e a d i n g l y h i g h v a l u e s f o r t h e e x t r a c t e d s o i l ATP. T h i s is p r o b a b l y c a u s e d b y h y d r o l y s i s of a d d e d A T P w h e n a p r o l o n g e d t i m e o f u l t r a s o n i f i c a t i o n h a s b e e n u s e d . S h a k i n g f o r 15 m i n w a s f o u n d t o b e m o s t s u i t a b l e f or t h e s o i l s e x a m i n e d , p r o v i d e d s o i l d i s p e r s i o n o c c u r s . If t h i s is n o t t h e c a s e , u l t r a s o n i f i c a t i o n for

1 or 2 m i n c a n b e u s e d to d i s p e r s e t h e s o i l a g g r e g a t e s .

T h e e f f e c t o f e x t r a c t a n t t o s o i l r a t i o o n e x t r a c t i o n of A T P w a s e x a m i n e d o n t h e s a n d y l o a m s o i l ( R o s k i l d e ) . A n e x t r a c t a n t t o s o i l r a t i o o f 1 0 : 1 r e m o v e d t h e s a m e a m o u n t o f A T P f r o m the s o i l as f o u n d b y u s e o f a r a t i o o f 2 5 : 1 (1.4 p g / g d . w t . s o i l ) . H o w e v e r it w a s d i f f i c u l t t o o b t a i n r e p r o d u c i b l e r e s u l t s w i t h the l a t t e r r a t i o . A r a t i o o f 5 : 1 o n l y r e m o v e d 0 .9 u g / g d . w t .

T a b l e 4. E f f e c t of s h a k i n g a nd u 1 1 r a s o n i f i c a t ion on t he e x t r a c ­ t i o n o f A T P f r o m s a n d y l o a m s o i l f r om R o s k i l d e (ref. X)

T e m p e r a t u r e in A d d e d ATP

D u r a t i o n of s o i l s u s p e n s i o n AT P c o n t e n t t r e a t m e n t a f t e r t r e a t m e n t r e c o v e r e d of s o i l *

T r e a t m e n t ( m i n.) (°C) ( % ) ( pg /g d .w t . s o i l )

S h a k i n g 1 3 99 0 . 64

S h a k i n g 2 3 99 0 . 68

S h a k i n g 3 3 89 0 .97

S h a k i n g 5 3 93. 1. 11

S h a k i n g 10 3 95 0 . 90

S h a k i n g 15 3 90 1 . 39

U l t r a s o n i -

f i c a t i o n 0 . 5 10 100 0 . 66

U l t r a s o n i -

f i c a t i o n 1 16 86 1 . 33

U l t r a s oni-

f i c a t i o n 2 23 93 1 . 30

U l t r a s o n i -

f i c a t i o n 3 28 73 1 .65

^ C o r r e c t e d for r e c o v e r y of a d d e d AT P by th e i n t e r n a l s t a n d a r d p r o c e d u r e .

R e s u l t s a re m e a n s of t r i p l i c a t e s a m p l e s .

26

T h e e f f e c t o n t h e A T P c o n t e n t of f i l t e r i n g s o i l s u s p e n s i o n s w a s e x a m i n e d ( T a b l e 5). T h e f i l t r a t i o n p r o c e d u r e o f t h e a c i d e x t r a c t s r e s u l t e d in 5 7 - 6 0 % d e c r e a s e in d i f f e r e n t s o i l t y pe s. I t is l i k e l y t h a t a s m a l l e r d e c r e a s e w o u l d h a v e b e e n o b s e r v e d if N R E $ ^ or R o d a l o n © h a d b e e n a d d e d b e f o r e t h e f i l t r a t i o n . W i t h o u t a f i l t r a t i o n p r o c e d u r e , t h e s o i l s u s p e n s i o n s c o n t a i n e d f r o m 1 . 4 to 1 . 6 % s o i l p a r t i c l e s of t h e s u s p e n s i o n u s e d f o r m e a s u r i n g A T P in d i f f e r e n t s o i l s ( T a b l e 5).

A n e x p e r i m e n t w a s a l s o p e r f o r m e d to s e e w h e t h e r t h e A T P m o l e c u l e s w e r e r e t a i n e d in t h e f i l t e r o r a d s o r b e d to s a n d / b e n t o n i t e ( T a b l e 6). F i l t r a t i o n of A T P d i s o d i u m s a l t s o l u t i o n s d i d n o t d e c r e a s e t h e r e l a t i v e A T P l i g h t u n i t s , i n d i c a t i n g t h a t A T P is n o t r e t a i n e d in t h e fi l t e r . O n t h e c o n t r a r y , f i l t e r i n g of a s a n d / b e n t o n i t e s u s p e n s i o n d e c r e a s e d t h e r e l a t i v e A T P l i g h t u n i t s w i t h 8 8 %, i n d i c a t i n g t h a t A T P m a i n l y is a d s o r b e d to t h e s a n d / b e n t o n i t e m i x t u r e .

soil type (0-20 cm depth)

soil suspension pg ATP/g d.wt.

soil

soil extract after f i l t r a t i o n ^

ug ATP/g d.wt.

soil

in ATP content after filtering

0'/0

in the suspe nsi on used for ATP

(w / v )

O'sO

J y n d e v a d ,

coarse sand 0.91 0.39 57 1.6

K o r n t v e d ,

coarse sand 0.86 0.35 60 1.5

Bal 1 um,

sandy loam 2.75 1 .17 58 1.4

Højer ,

silty clay 2.46 1.02 59 1.4

Means of duplicate samples.

ATP me thod (ref. X ).

1) Whatman no. 5 filterpaper was used: The acid soil s uspensions were filtered before the neutralization.

The soils were sampled in May 1985, adjusted to 60 % of w.h.c. and preincubated for 5 day at 25°C.

28

T a b l e 6. The e f f e c t of f i l t r a t i o n on t he c o n t e n t of ATP a d d e d to a m i x t u r e of s a n d / b e n t o n i t e

A TP . d i s o d i u m W i t h o u t A f t e r

s o l u t i o n s f i l t r a t i o n f i l t r a t i o n ^

e x t r a c t e d rel. l i g h t c o u n t s rel. l ig h t c o u n t s

A T P (0 .5 ml of 8 p M ) a d d e d to

10 ml e x t r a c t a n t a g e n t a n d q-j y

p a s s e d the A TP e x t r a c t i o n p r o c e d u r e

A T P (0.5 ml of 8 y M ) a d d e d to 9 .5 ml e x t r a c t a n t a g e n t and 1 g p o r t i o n of s t e r i l i z e d s a n d / b e n t o n i t e ( r a t i o 4 /1)

562 67

M e a n s of d u p l i c a t e s a m p l e s . A T P m e t h o d (ref. X).

1) W h a t m a n no. 5 f i l t e r p a p e r w a s use d. T h e a c i d s o l u t i o n s w e r e f i l t e r e d b e f o r e t he n e u t r a l i z a t i o n .

No c o r r e c t i o n w i t h s t a n d a r d s .