Biokemi og Genetik
Phosphatidylinositol 3-kinase som signalmolekyle
Især undersøges en række af os opdagede nukleo-lære RNA molekyler. Undersøgelserne omfatter bl.a. genkloning og ekspressionsanalyser, kemisk og enzymatisk strukturprobning samt forskellige former for partikelkarakterisering. I forlængelse af de strukturelle studier undersøges om RNA mo-lekylerne har funktion i forbindelse med forar-bejdning af forstadier til ribosom RNA. I et be-slægtet projekt undersøges struktur-funktionsrela-tioner for en ny klasse af ribozymer (RNA enzy-mer). Disse ribozymer forventes at kunne udvikles til bioteknologisk anvendelige molekyler (Henrik Nielsen).
Biomolekylær genkendelse
Gruppens forskning defineres som biomolekylær genkendelse, med særlig reference til det geneti-ske materiale DNA, og med henblik på at udvikle syntetiske reagenser, som er i stand til at genkende DNA’et på en sekvensspecifik måde. Sådanne rea-genser kan anvendes til at modulere genekspres-sionen og har derved et meget stort anvendelses-potentiale i molekylærbiologiske undersøgelser af enkelte geners biologiske funktion og ikke mindst i udviklingen af gen-terapeutika. Denne forskning har bl.a. ført til udviklingen af et DNA-lignende molekyle, PNA (akronym for »Peptide Nucleic Acid«), som kemisk set er en hybrid mellem et peptid og et DNA-molekyle, men som uagtet dets kemisk set ringe lighed med DNA har bibeholdt DNA’ets strukturelle egenskaber. PNA anses for at være et af de bedste bud på en »lead«-forbindelse til udvikling af næste generation af »antisense« og
»antigene« gen-terapeutika. Forskningen er dels koncentreret om at videreudvikle PNA-teknologi-en i kemisk hPNA-teknologi-ensePNA-teknologi-ende, dels om at studere de mo-lekylære mekanismer bag PNAs genkendelse af DNA og RNA. Endelig prøver vi at udvikle et PNA gen-terapeutikum rettet mod et cancer-relateret gen, for hvilket forøget aktivitet er karakteristisk for malign brystkræft (Peter Nielsen, Leif Chri-stensen, Helle Knudsen, H. Jakob Larsen, Niels Erik Møllegaard, Jens Nederby Nielsen, Thomas Bentin).
Kongresser, rejser, gæsteforelæsninger, m.v.:
Inge og Eigil Bojesen: Gæsteforelæsere på Sem-melweis University, Budapest, Ungarn.
Peter E. Nielsen: »Modified Nucl. Acids. Che-mistry & applications«, Cold Spring Harbor, USA;
»3rd Ann. Med. Chem. Symposium«, Buffalo, USA; »PNA-RMC meeting«, Boston University, USA; »International Congress. Therapeutic Oli-gonucleotides«, Rom, Italien; »International Bi-ophys. Congress«, Amsterdam, Holland; »Cancer Drug Discovery Conference«, Killarney, Irland;
»Kemia 96«, Helsinki, Finland; »International
Symposium on Life Chemistry«, Beijing, Kina;
»The Augustusburg Conference«, Augustusburg, Tyskland; »Symposium on Biotechnology«, Stock-holm, Sverige; »International Conference«, Asco-na, Schweiz.
Disputats- og andre bedømmelseskomiteer:
Sune Frederiksen: Formand i adjunktbedømmel-sesudvalg ved KU; formand i Ph.D.-bedømmelses-udvalg ved KU.
Biokemisk afdeling C Forskningsvirksomhed:
Afdelingens forskningsaktiviteter omfatter op-rensning og karakterisering af proteiner og hor-moner, studier af normale og patologiske proces-ser knyttet til biologiske membraner samt under-søgelser af de molekylære forandringer, der op-står ved stimulering og hæmning af cellevækst.
Sigtet med en del af afdelingens forskning er at belyse basale cellebiologiske fænomener, som ved-rører biosyntese og intracellulær transport af membranproteiner, signaltransduktion og aktive-ring og reguleaktive-ring af blodcirkulation og fibrinoly-se. En sådan forøget viden er af betydning for for-ståelsen af normale og patologiske cellers fenoty-pe og af proteiners og hormoners funktion.
Insulin signaltransduktion
Insulin stimulering af metaboliske processer.
Ved anvendelse af hepatocytter fremstillet med EDTA perfusionsmetode i stedet for den traditio-nelle collagenase metode studerer vi insulins ef-fekt på metaboliske processer. Glycogensyntesen kan øges 2 gange ved insulinstimulation. For at studere signalveje for den insulinstimulerede glycogensyntese blev effekten af forskellige inhibi-torer undersøgt. Forsøgene tyder på at phosphati-dylinositol 3-kinase er et af signalmolekylerne, li-gesom en aktiv MAP kinase er nødvendig. Prelimi-nære undersøgelser har vist, at vi i isolerede he-patocytter fra fastede og refodrede rotter også op-når en øget lipogenese ved insulin stimulering.
Klarlægning af signalvejen for lipogenesen i he-patocytter er ved at blive undersøgt. Studierne fo-regår i samarbejde med lektor J. Vinten Med. Fys.
Inst. (Jens Carlsen, Kirsten Christiansen).
Phosphatidylinositol 3-kinase som
substrat 1, PI 3-kinase og phosphotyrosin efter in-sulinstimulation af cellerne. PI 3-kinasens subcel-lulære lokalisation samt effekten af inhibitorer på aktiviteten undersøges. Preliminære forsøg på he-patocytter fra fastede rotter tyder på at der findes tre pools af PI 3-kinase aktivitet, som kunne re-præsentere forskellige signalveje i hepatocytter (Jens Carlsen, Kirsten Christiansen).
Oxidativ phosphorylering
Hos visse patienter der har gennemgået en hjerte-operation har vi i serum påvist en faktor, der af-kobler den oxidative phosphorylering. I et test sy-stem bestående af isolerede rotte mitochondrier undersøger vi i samarbejde med 1. reservelæge Ul-rich Andersen, Ou og overlæge Lars Willy Ander-sen, RH karakteren af denne påvirkning. En ind-ledende forsøgsrække har sandsynliggjort at på-virkningen af den oxidative phosphorylering skyl-des den extrakorporale cirkulation under opera-tionen. Graden af afkoblingen kvantiseres i for-hold til kendte afkoblere (Jens Carlsen, Kirsten Christiansen).
Membrantransport af lipophile molekyler
Under anvendelse af nye computer modelbereg-ninger undersøges hvorledes binding af lipophile anthracycliner til serum albumin indvirker på stof-fernes evne til at omgå tumorcellers resistensme-kanismer overfor cytostatika. Arbejdet omfatter en eksperimentel del, hvor membrantransport af en række klinisk vigtige anthracycliner karakteri-seres i multidrug-resistente Ehrlich ascites tumor-celler. Projektet vil kunne bidrage med grund-læggende viden, der er nødvendig for at bedøm-me nye anthracycliners egenskaber ud fra et teo-retisk og biokemisk grundlag. Samarbejde med E.Friche, RH (Erland J. F. Demant).
Transskriptionel regulering
HNF1 transskriptionsfaktorer spiller en væsentlig rolle ved transskriptionen af en række gener i epithel væv. Således har HNF1-faktorerne betyd-ning bl.a. for reguleringen af aminopeptidase N, sukrase-isomaltase og laktase-phorizin hydrolase generne. HNF1-faktorerne findes i to forskellige former,-alfa og beta, som er aktive enten som he-tero- eller homo-dimere og derved påvirker deres målgener forskelligt. Det er af interesse at studere fordelingen af alfa- og betaformerne af HNF1 langs krypt/villus aksen for at opklare om én eller begge faktorer er af betydning for reguleringen af ekspressionen langs krypt/villus aksen. Hertil er det nødvendigt at have adgang til specifikke anti-stoffer til de to former. Vi har fremstillet antistof mod HNF1-alfa i kanin ved at ekspressere det unikke HNF1-alfa-domæne i E. Coli og bruger
dette som antigen. HNF1-beta antistoffet er frem-stillet af Moshe Yaniv´s gruppe i Paris. Det er nu muligt ved en kombination af elektroforetisk mo-bilitets analyse (EMSA) og fraktionering af krypt villus celler- alternativt ved immuno histokemi- at kortlægge fordelingen af de to former af HNF1 langs krypt/villus aksen.
Aminopeptidase N transkriptionen er reguleret af to promotorer. En epithelial promoter, som er aktiv i epiteliale celler og er placeret umiddelbart opstrøms for den kodende del af genet og en my-eloid promoter (som er aktiv i mymy-eloide celler) er placeret ca. 8 kB længere opstrøms.
Mellem disse to promotorer har vi identificeret en bona fideenhancer, som nu er blevet karakteri-seret i detaljer. Vi har således vist at enhanceren kan stimulere en heterolog promoter (SV40 early) både fra en opstrøms og en nedstrøms position.
Aktiviteten er orienteringsuafhængig. Enhance-ren har en variabel aktivitet i en række epiteliale og hæmatopoetiske celletyper og er bygget op af fem cis-elementer, hvoraf de fire første alle er nød-vendige for enhancerens konstitutive aktivitet. Det femte cis-element indeholder et perfekt bindings-site for serum respons transskriptionsfaktoren, hvilket tyder på at dette element kan være involve-ret i vækstfaktor induceinvolve-ret aminopeptidase N eks-pression.
Karakteriseringen af cis-elementer og tilhøren-de transfaktorer i laktase-phlorizin hydrolase (LPH) promoteren er fortsat. I den 1 kB flanke-rende region er seks cis-elementer blevet identifi-ceret og funktionen af disse er undersøgt. Herved er det blevet fastlagt at cdx-2 og HOXC11 binder til CE-LPH1. De er begge homeodomæne-protei-ner. Deres indbyrdes funktionelle rolle er endnu uopklaret. Vi har ved mutations analyser og foot-printing vist, at det er sandsynligt at cdx-2 rekrut-terer en endnu ikke identificeret faktor, som synes at være afgørende for om cdx-2 virker som aktiva-tor eller repressor. Den isolerede HOXC11 klon er blevet sekventeret. Ved primer extention og iso-lering af yderligere kloner af samme størrelse er det blevet sandsynligjort at vi har isoleret en fuld-længde klon idet også størrelsen er i overensstem-melse med størrelsen af HOXC11 kodende mRNA (northern blotting). Vævsdistributionen af HOXC11 er blevet studeret ved Northern-blot-ting. Tarmvæv har størst mængde af HOXC11, hvilket peger på en funktionel rolle.
En enhancer er blevet identificeret i den 1kB flankerende region. Den har to HNF1 elementer.
Endvidere er en repressor blevet identificeret, som synes at være reguleret af en HNF3 lignende faktor (FREAK3). Vi har også for nylig identificeret en se-kvens i LPH-promoteren, som er identisk med et repressor element i »Fatty acid binding
protein«-Biokemi og Genetik
173
promoteren. En undersøgelse af betydningen af dette element for reguleringen af LPH er påbe-gyndt. De ovennævnte transkriptionsfaktorer er sandsynligvis involveret i den differentieringsaf-hængige regulering af LPH, som vides at være påvirket af ekstracellulær matriks. Et arbejde er påbegyndt som sigter på at kortlægge de involvere-de signaltransduktionsveje (Klaus Kockholm, Cat-hy Mitchelmore, Ove Norén, Jørgen Olsen, Hans Sjöström, Nikolaj Spodsberg, Jesper Troelsen).
Intracellulær protein-transport og sortering
Vi har vist at glycolipid mikrodomæner (rafts) iso-leret fra enterocytter indeholder store mængder børstesømenzymer, hvilket indikerer at »rafts« har betydning for transporten af disse proteiner til den apikale membran. I det forløbne år har vi ar-bejdet med at oprense og karakterisere uidentifi-cerede proteiner i »rafts« med det formål at finde proteiner, som er af betydning for transport og sortering af børstesøm enzymerne. Således har vi identificeret to medlemmer af annexin familien (annexin II og XIII) og et galaktose bindende protein (galectin-4). Det er kendt fra litteraturen at annexiner er involveret i endocytotiske og exo-cytotiske processer hvilket peger på, at disse prote-iner også har en rolle i den apikale transport af børstesøm enzymer. Galectin-4´s rolle i denne sammenhæng er ukendt, hvorfor vi arbejder på at klarlægge dette proteins placering i transportpro-cessen. Ved immunoelektron mikroskopi har vi fundet at galectin-4 forekommer i børstesømmem-branen i tilknytning til aminopeptidase N mærk-ning. I cytoplasmaet ses det associeret til filamen-ter og små vesikler. Galectin-4 har ikke et signal-peptid og secerneres derfor via en ukendt meka-nisme. Vores fund peger i retning af, at galectin-4 hjælpes ud til børstesømmembranen af apikale transport vesikler.Sekretoriske former af aminopeptidase N sorte-res ligesom den membranbundne form til den apikale side af MDCK-celler hvorimod regulatori-ske sekretoriregulatori-ske proteiner secerneres jævnt for-delt til basolateral- og apikal membranen. Dette indikerer at ektodomænet indeholder informatio-nen om apikal sortering af sekretoriske former af aminopeptidase N. Dette domæne består af ca.
900 aminosyrer som bl.a. danner 10 N-glycosyle-ringssite. Størrelsen på molekylet gør det vanske-ligt at identificere det apikale sorteringssignal. Det er af en anden gruppe blevet demonstreret, at ad-dition af N-bunden glycosylering til et usorteret sekretorisk protein resulterer i apikal sortering af det pågældende protein. For at undersøge om N-bunden glycosylering generelt virker som et api-kalt sorteringssignal og for at undersøge hvilke aminosyresekvenser som er afgørende, er et
stu-dium over transport og sortering af en familie af serpiner påbegyndt. De forskellige serpiner sorte-res med forskellig effektivitet til den apikale side af MDCK-celler. Konserverede domæner i de api-kalt sorterede proteiner er kandidater til apikale sorterings domæner. I et samarbejde med George V. Avvakumov, University of Western Ontario, London, Ontario, Canada har vi adgang til en række mutanter af en af de apikalt sorterede ser-piner (Corticoid Bindende protein), hvilket giver en alternativ mulighed for at identificere do-mænet som er ansvarlig for den apikale sortering.
Studierne over endosomernes rolle som sorte-ringsorganel i exocytosen er fortsat. Således er en-docytosen af forskellige markører (peroxidase og ovalbumin) fra apikal og basolateral membranen undersøgt i MDCK celler. Derved kan eksistensen af forskellige endosomtyper fastlægges og den funktionelle forbindelse mellem apikale og baso-laterale endosomer afklares. Forekomsten af api-kale proteiner i endosomerne kunne pege på en rolle for disse i exocytosen og sortering. Studier af den basolaterale til apikale transcytose i enterocyt-ter er påbegyndt. I denne forbindelse er immuno-elektronmikroskopisk analyse af Rab-17 blevet ud-ført for at belyse dette molekyles rolle i transcyto-sen. For at opklare hvorvidt den basolaterale-api-kale transcytose af IgA benytter den samme finale transport rute som aminopeptidase N er de im-munoelektronmikroskopiske studier fortsat for at undersøge om basolateralt endocyteret IgA er co-lokaliseret med aminopeptidase N (E. Michael Danielsen, Gert H. Hansen, Jacob Larsen, Ove Norén, Hans Sjöström, Lotte K. Vogel).
Differentiering af tarm-kryptceller
Et arbejde med det formål at identificere mar-kører for tyndtarmepitel stamceller er påbegyndt som en indledning til at studere disses differentie-ring. En metode for isolering af rotte enterocytter fra forskellige positioner langs krypt/villus aksen er etableret. Det er planen at vi ved hjælp af et aminopeptidase N antistof skal fjerne villus ente-rocytter og de øverste kryptceller, således at de udifferentierede kryptceller efterfølgende kan bruges til fremstilling af et kryptcelle specifikt cDNA-bibliotek. Klonernes cellulære oprindelse skal undersøges med in situhybridisering og klo-ner med en stamcelle lignende placering skal ana-lyseres primært med sekventering (Anders Clau-sen, Ove Norén, Jørgen OlClau-sen, Hans Sjöström).
Cøliaki
Ved sygdommen cøliaki reagerer tyndtarmsmuko-sa på gliadiner i hvedemel med atrofi af villi og hy-pertrofi af krypter. Vi studerer i dette projekt de patogenetiske mekanismer ved denne sygdom og
har holdepunkter for en patologisk T-celle medie-ret immunolgisk reaktion medie-rettet mod hvedegliadi-nerne. Vi har etableret et samarbejde med Knut Lundin og Ludvig Sollid, Rikshospitalet Oslo og defineret forskellige intestinale T-cellekloners reaktivitet overfor oprensede og karakteriserede gliadiner. Arbejdet er fortsat med kortlægning af reaktive peptidfragmenter hvorefter disse er ble-vet delvist sekventeret og sammenlignet med se-kvenser af klonede gliadiner. Sandsynlige sekven-ser er herefter blevet syntetisekven-seret. Disse visekven-ser bin-ding til det antigenpresenterende system men ikke in vitro aktivering af tilsvarende T-celleklo-ner. Vi har endvidere fundet holdepunkter for at gliadiner skal modificeres for at blive fuldt immu-nologiskt aktive, og har i samarbejde med Peter Roepsdorff, Odense Universitet sandsynliggjort at denne aktivering skyldes deamidering af en eller flere glutaminer. Vi arbejder for nærværende med at undersøge hvorvidt gliadiner i mel kan deami-deres enten ved gærings/bagningsprocessen eller under den gastrointestinale fordøjelse (Hans Sjöström, Ove Norén).
Blodkoagulationen: Dets aktivering og regule-ring
Initieringsmekanismen, som involverer faktor XII i kogulationssystemet synes nu at være klarlagt, idet en konformationsændring af faktor XII og adherering til en negativ ladet overflade induce-rer proteolytisk aktivitet. Vi har tidligere vist, at den phospholipid (PL) medierede autoaktivering af faktor XII er betinget af tilstedeværelsen af Zn2+, som forårsager konformationsændringen.
Sulfatid er vist ikke alene at bibringe factor XII en passende aktiverende overflade men også at kun-ne inducere den konformationsændring, som Zn2+er vist at forårsage. Faktor XII er vist at have et højaffint og 3 lavaffine bindingssteder for Zn2+. Ved aktivering af faktor XII mistes det ene af disse 4 bindingssteder. Vi har lokaliseret tre af de fire bindingssteder.
Den del af blodkoagulationen som udgøres af factor XII, prekallikrein og kininogen menes at spille en langt større rolle i fibrinolysen end i koa-gulationen. Vi berettede sidste år at aktiveret fak-tor XII har plasminogenolytisk aktivitet. De kineti-ske konstanter er blevet målt og sammenlignet med tilsvarende for urokinase, en kendt aktivator af plasminogen. Disse har bekræftet at factor XII spiller en ikke ubetydelig rolle ved aktivering af plasminogen. Der synes at være indbygget en re-gulering i aktiveringssystemet. Dette er vi nu i gang med at undersøge.
ß2-Glycoprotein-I (ß2-GP-I) er en intern regula-tor af fakregula-tor XII aktiveringen. Det menes at være et nødvendigt antigen ved analyse af
anti-phos-pholipid antistoffer som optræder i plasma fra vis-se patienter med thrombovis-ser og lupus anticoagu-lans (LA) (koagulationshæmmende komponen-ter) i plasmaet. I samarbejde med læge Bo Bas-lund, Hvidovre Hospital har vi med en modifice-ret metode undersøgt specificiteten af disse anti-stoffer overfor phospholipid, ß2-GP-I og ß2-GP-I i kompleks med phospholipid. I musemodeller er vi i gang med at forsøge at inducere anti-phos-pholipid antistof syndrom ved immunisering med ovennævnte antigener (Line Heinesen, Rasmus Røjkjær, Inger Schousboe).
Kongresser, rejser, gæsteforelæsninger, m.v.:
E. Michael Danielsen: Keystone Symposium on
»Cell Polarity«, Lake Tahoe, USA.
Klaus Kokholm: EMBL Meeting on Transskrip-tion, Heidelberg, Tyskland.
Ove Norén: Inviteret foredragsholder til Euro-pean Society Pediatric Gastroenterology, Mün-chen, Tyskland; Falk-symposium »Molecular and Cell biology of the Gut«, Freiberg, Tyskland; invi-teret foredragsholder til 5th United European Gastroenterology Week, Paris, Frankrig.
Jørgen Olsen: Falk-symposium »Molecular and Cell biology of the Gut«, Freiburg, Tyskland; 45th Harden Conference »Gastrointestinal Function in Health and Disease«, London, England; inviteret foredragsholder til Sonderforschungsbereich 387
»Cellular proteases«, Magdeburg, Tyskland.
Inger Schousboe: XIII Int. Congress on Fibrino-lysis and ThromboFibrino-lysis, Barcelona Spanien; Inter-national Society of Thrombosis and Haemostasis, Barcelona, Spanien; 7th International Symposium on Antiphospholipid antibodies, New Orleans, USA; Inviteret foredragsholder i Dansk Reumato-logisk Selskab.
Hans Sjöström: 45th Harden Conference
»Gastrointestinal Function in Health and Disea-se«, London, England; Alfred Benzon Symposium 40: HLA and Disease. Molecular Basis, København Danmark; 7th International Symposium on Celiac Diease, Tammerfors, Finland; inviteret foredrags-holder til 5th United European Gastroenterology Week, Paris, Frankrig.
Nikolaj Spodsberg: EMBL Meeting on Trans-cription, Heidelberg, Tyskland.
Jesper Troelsen: Inviteret foredragsholder til Falk-symposium »Molecular and Cell Biology of the Gut«, Freiburg, Tyskland.
Lotte Vogel: Biokemisk Forenings Årsmøde, Fuglesø, Danmark; 6th International congress on Cell Biology & 36th American Society Cell Biology Annual meeting, San Francisco, USA.
Disputats- og andre bedømmelseskomiteer:
E. Michael Danielsen: Ph.D.-afhandling ved KU.
Biokemi og Genetik
175
Ove Norén: Lektorat i membranbiologi ved KU.
Inger Schousboe: Disputatsbedømmelseved KU;
Ph.D.-bedømmelse Ved KU.
Hans Sjöström: Kennedy Instituttets faglige råd under Socialministeriet; bedømmelsesudvalg til besættelse af professorat i Medicinsk Fysiologi.
Foreningsvirksomhed:
Inger Schousboe: Medlem af The European Fo-rum on Antiphospholipid antibodies.
Afdelingen for Medicinsk Genetik Forskningsvirksomhed:
Afdelingens forskning vedrører normalgenetisk variation hos mennesket (human genetik) samt årsagerne til og virkningen af ændringer i arvean-læg og kromosomer, der kan medføre sygdomme (medicinsk genetik). Forebyggelse af disse gene-tisk betingede sygdomme forudsætter, at man kan karakterisere de sygelige processer på celle og mo-lekylært niveau, relatere dem til de kliniske symp-tomer og benytte dem i diagnostisk øjemed.
Human genetikken, som er i voldsom ekspan-sion, er nøgle til andre medicinske fag. Forsknin-gen er også grundlag for vores Forsknin-genetiske rådgiv-ning og diagnostiske kromosom- og DNA-under-søgelser. Afdelingen får derved kontakt med prak-tiserende læger, hospitalsafdelinger og patienter.
Niels Tommerup tiltrådte som professor i medi-cinsk genetik den 1. maj 1996, og har via en særbe-villing fra fakultetet oprettet et nyt molekylær-ge-netisk laboratorium på afdelingen for Medicinsk Genetik. Det overordnede formål for dette mole-kylær-genetiske laboratorium er at identificere og isolere nye sygdomsgener ud fra kendskabet til den kromosomale lokalisation af gener og syg-domme og ud fra kendskab til geners ekspres-sionsmønster.
Cytogenetik
Sygdomsassocierede kromosombrud
Ved en lang række arvelige sygdomme har et fåtal af patienterne en mikroskopisk synlig mutation, ofte i form af translokationer med kromosombrud i et specifikt gen. Disse kromosombrud kan benyt-tes til kortlægning, isolering og identifikation af de ansvarlige sygdomsgener. Systematisk kromo-somanalyse af udvalgte patientgrupper foretages, bl.a. ved type 2 diabetes (samarbejde med O. Pe-dersen og T. Hansen, Steno Diabetes Center).
Endvidere koordineres en international registre-ring, indsamling af materiale og systematisk kort-lægning og kloning af sygdomsassocierede kromo-sombrud med mere end 170 samarbejdspartnere globalt (Niels Tommerup).
Centromerregionen i menneskets kromosomer indeholder repetetivt DNA specifikt for denne re-gion. Desuden ses centromerkarakteristiske prote-iner, hvoraf nogle er en permanent del af regio-nen og andre dannes/vandrer hertil under kro-mosomdelingen. Under delingen dannes her en proteinstruktur, kinetochoret, som er tilhæft-ningssted for mikrotubuli og samlingssted for de motoriske proteiner (kinesin, dynein), der med-virker til kromosomadskillelse og transport til cel-lepolerne (anafasebevægelsen). Et defekt kineto-chor kan derfor medføre unormal kromosombe-vægelse med tab af kromosomet.
Tilstedeværelsen af/mangel på kinetochorud-vikling eller en defekt kinetochorstruktur under-søges elektronmikroskopisk og sammenlignes med mitoseforløbet i kromosomer med forskelli-ge former for centromerdefekt. Centromerspeci-fikke antistoffer anvendes til karakteristik af cen-tromerdefekterne (Annelise Wandall).
Organisationen af de ribosomale 5S rRNA ge-ner hos hvirveldyr er langt mere varieret end tidli-gere antaget. Opbygningen af selve 5S rRNA ge-net på 121 bp er vidtgående konserveret hos for-skellige arter, mens størrelsen og opbygningen af de flankerende sekvenser varierer meget. Således forekommer generne i repeterede enheder på mellem 1 – 8 kb, afhængig af hvilket hvirveldyr, vi taler om. Ved sekvensanalyse, karakterisering af restriktionskort og in situ hybridisering med pro-ber fra rottens 5S rRNA gen- »repeats« har vi fun-det, at rottens ægte gener og dens pseudogener er lokaliseret til hvert sit kromosompar (samarbejde med G. Levan, Göteborg Universitet).
Hos mink har vi, i overensstemmelse med zoo-FISH undersøgelser, fundet et stort område på kromosom 2p, der er syntent med den lange arm på kromosom 1 hos mennesket. Vores undersøgel-ser tyder på at der er tre loci hos mink, der inde-holder 5S rRna gener (samarbejde med K. Chri-stensen, KVL).
Vores observationer af in situ hybridisering til humane og andre vertebratkromosomer med gen-specifikke prober viser, at der ved detektion med fluorescensmærkede prober (FISH) kan tabes mere end en trediedel af den information, vi op-når med tritierede prober (RISH).
I samarbejde med P. Nielsen (Center for Bio-molekylær Genkendelse) er vi ved at undersøge in situ hybridisering med PNA prober. De er specifik-ke, så længe de er meget små (under 20-mer). Vi anvender prober, der er komplementære til en del af 5S RNA genet. Disse model-studier kan mu-ligvis afklare en mere principiel anvendelse af PNA prober til in situ hybridisering (Bodil Lom-holt, Sune Frederiksen, Charlotte Hallenberg, Lars Riff Jensen).
Det kliniske billede ved tab af materiale (dele-tion) fra den korte arm af kromosom 5 (5p-) er af-hængig af deletionens størrelse og det tabte områ-des lokalisation; hertil kommer, at en del personer med 5p- har større eller mindre dele af ekstra ma-teriale (duplikation) fra et andet kromosom. Man kan derfor tale om mange, vidt forskellige 5p- syg-domsbilleder. Det hyppigste og bedst kendte af disse er cri du chat syndromet, hvis kliniske karak-teristika -i typiske tilfælde- er en ejendommelig, mijavende gråd, let genkendelige ansigtstræk og en psykomotorisk udvikling som voksen svarende til et normalt 3-4 års barn. De øvrige (sjældnere) og mere eller mindre velafgrænsede sygdomsbille-der er karakteriseret af en stor variationsbredde, især hvad angår den psykomotoriske udvikling spændende fra det helt normale til særdeles svær mental retardering. En nøje afklaring af kromo-somfejlens natur og udstrækning i hver enkelt fa-milie er derfor en nødvendig forudsætning for in-dividuel genetisk rådgivning og for – på længere sigt – at lokalisere/isolere de kromosomale områ-der, der af betydning for udviklingen af de klini-ske symptomer. Med udgangspunkt i knap 150 5p-tilfælde fra ind- og udland er den detaljerede ud-redning af den enkelte persons kromosomfejl fortsat. Mikrodissektion af kromosom 5´s korte arm, efterfulgt af DOP-PCR, biotin-indmærknig og tilbagehybridisering til normale kromosomer er gennemført med varierende succes (H. Ham-merbak). In situ hybridisering med cosmider og selekterede YAC kloner samt polymorfe mikrosa-tellit systemer har i de fleste familier givet en ri-melig, men stadig ret grov identificering af de en-kelte personers brudsteder. Yderligere 58 YAC klo-ner, der dækker de mest interessante områder af 5p samt enkelte BAC´s og P1 kloner, er opforme-ret (X-X Zhang) og klar til den mere detaljerede kortlægning.
Et ældre materiale (1970’erne) af kranierønt-genprofilbilleder fra 23 cri du chat personer er blevet revurderet af I. Kjær (Odontologisk Insti-tut). De foreløbige resultater tyder på udviklingsa-nomalier i basis cranii, specielt i dorsum sellae og clivus; denne kraniale region udvikles fra den del af notokorden, som er ansvarlig for dannelsen af de dele af det centrale og perifere nervesystem, der er abnormt hos cri du chat personer (Erik Niebuhr).
Comparativ Genomisk Hybridisering (CGH) er etableret og valideret vha. en nontumorigen mam-macellelinie, HHT-3522. En sublinie er spontant blevet tumorigen. Konventionel cytogenetik har tidligere påvist en enkelt kromosomforandring (deletion 7p), hvorimod CGH viser, at tumorige-nisiteten er associeret med to yderligere genetiske forandringer. Celleliniens forskellige sublinier
bruges som modelsystem for den tumorigene progression i brystceller. Tumorsuppressorgenet TP53 muteres under denne progressive udvikling.
Vha. allelspecifik PCR, FISH, cytogenetik samt kromosomflowsortering foretages nærmere karak-terisering af det nøjagtige tidspunkt og ved hvil-ken mekanisme mutationen overgår fra heterozy-got til homozyheterozy-got stadium. Digitalt billedbehand-lingsudstyr med ikke-kommercielt software vedli-geholdes og videreudvikles. Udstyret anvendes til-lige til: Single-copy FISH, chromosome painting, reverse painting, FISH med cosmider, YAC’s, BAC’s og PNA prober samt telomerhybridiserin-ger (Kirsten V. Nielsen, René Villadsen, Søren Holstebroe).
Genekspression samt kortlægning af markører, komplekse normalegenskaber og sygdomme Kortlægning af nye gener
De fleste genetiske sygdomme og dispositioner er eller vil blive kromosomalt kortlagt, f.eks. ved kob-lingsanalyse. Kromosomal kortlægning af gener kan derfor identificere nye, potentielle positions-kandidatgener for specifikke sygdomme. Ved fluo-rescens in situ hybridisering (FISH) af cDNA klo-ner er mere end 60 nye humane geklo-ner blevet kort-lagte, i samarbejde med inden- og udenlandske grupper bl.a. K. Brøndum-Nielsen, H. Vissing, H.
Leffers, B. Honoré, F. Rauscher, P. Gromov, J. Ce-lis. FISH-kortlægning kombineres nu med PCR-analyse af et panel af radiation hybrid celle linier (Niels Tommerup, Claus Hansen).
Kortlægning af genekspression under fosterud-viklingen
Karakterisering af den normale og abnorme funk-tion af de tusindvis af nye gener og genprodukter bliver et nøglefelt i fremtiden. For at identificere gener der er associeret med specifikke medfødte misdannelser foretages en systematisk analyse af genekspression i forskellige fostervæv og -stadier.
Differentielt udtrykte gener identificeres vha.
mRNA differential display teknik, bl.a. for at iden-tificere kendte og ukendte gener der er involveret i udviklingen af f.eks. testis, ovarier og det aksiale skelet. I forbindelse med dette projekt er der givet tilladelse til en systematisk indsamling af føtalt væv fra fosteruge 6-13 med henblik på isolering af RNA. Det forventes tillige, at dette projekt vil føre til identifikation af en række ukendte gener, samt identifikation af gener, der er involveret i funda-mentale biologiske processer, f.eks. programme-ret celledød (apoptose). Samarbejde med H. Lef-fers, S. Gammeltoft, M. Strauss, A. G. Byskov, T.
Greve, L. Westergaard (Niels Tommerup, Claus Hansen, Nana Rendtorff).
Biokemi og Genetik